Analisi PCR
quantitativa
Real
time
PCR
Perché Real-Time?
Misura l'amplificazione in tempo reale durante la fase
esponenziale della PCR, quando cioè l'efficienza di
amplificazione è influenzata minimamente dalle variabili di
reazione, permettendo di ottenere risultati molto più
accurati e quantitativi
Real
time
PCR
Analisi
PCR
Analisi PCR
quantitativa
quantitativa
impiego di marcatori fluorescenti
il cui accumulo segue la
stessa cinetica della reazione
PCR. La misurazione della
fluorescenza dà in tempo reale la
quantità dello specifico prodotto
di PCR
Termociclatore
con detector per
fluorocromi e
software per
analisi dati
Linea di base (baseline):
valore al di sopra del quale inizia
l’accumulo di un amplificato
Linea soglia (Threshold): scelta dall’operatore
in modo da intersecare le curve di tutti i campioni
nella fase esponenziale
Ciclo soglia: E’ il ciclo della reazione di amplificazione
in cui il segnale di fluorescenza del campione è maggiore
rispetto a quello della Threshold
Linea soglia scelta
d a l l ’ o p e r a t o r e
In maniera da intersecare le
curve di tutti i campioni nella
fase esponenziale
Indica il valore al di sopra del quale
inizia l’accumulo di un amplificato
E ’ i l c i c l o d e l l a re a z io n e d i
amplificazione in cui il segnale
di fluorescenza del campione è maggiore rispetto a
q u e l l o
d e l l a
T h r e s h o l d
Real time PCR
Sistemi di rilevamento
1. Coloranti che si intercalano
nella doppia elica
SYBR Green 1
La molecola fluorescente si lega random a tutte le
doppie eliche, includendo i dimeri di primers
È necessario ottimizzare la metodica per evitare la
formazione di prodotti aspecifici
All’inizio del processo di amplificazione,Tm
la miscela di
reazione contiene DNA denaturato, primers e la
molecola fluorescente
Durante l’allungamento si verifica un aumento di
fluorescenza che corrisponde all’ aumento del numero di
copie dell’amplicone
SYBR Green 1
metodica semplice, non costosa
MA aspecifica
Analisi della curva di melting
82.6
88.1
melting peak
Tm
2. Sonde specifiche marcate
con molecole fluorescenti
Sonde TaqMan
La sonda di tipo TaqMan è un oligonucleotide che, come i
primers della PCR, viene disegnato per essere
complementare alla sequenza bersaglio da amplificare: è
disegnata in modo da ibridarsi all’interno
del frammento amplificato nella reazione di PCR
Primer 3’
5’
3’
R
Q
5’
Q
3’
3’
5’
3’Primer 5’
5’
R
3’
3’
REPORTER: fluorocromo ad alta energia che emette
fluorescenza
fluorocromo a bassa energia che spegne la fluorescenza del
reporter
5’
5’
3’
Si libera 1 molecola
di reporter per ogni
copia di DNA
duplicata
5’
5’
Se R e Q si trovano vicini, Q spegne l'effetto di
R perchè i fotoni di R vengono assorbiti da Q
3’
3’
5’
3’
R
5’
Q
5’
5’
Probe
Forward primer
Reverse primer
Quantificazione
ASSOLUTA
i campioni sono quantificati in modo assoluto
Necessita di standard di cui si conosce la concentrazione
assoluta (utilizzo di una standard curve)
Per tutti gli unknowns devono essere saggiate identiche
quantità di campioni
RELATIVA la quantificazione viene effettuata paragonando i CT
Necessita di controlli endogeni (non si utilizza una
standard curve)
Gli unknowns vengono “quantificati” paragonando il loro
con quello del controllo endogeno
CT
VOGLIO QUANTIFICARE IN TEMPO REALE LA
PRESENZA DI UN MICRORGANISMO ALL’INTERNO
DI UNA MATRICE
1. Devo avere a disposizione una sonda specie-specifica
in grado di amplificare una regione specifica del genoma
del microrganismo in esame, di dimensioni comprese tra
100-700 bp
 verifica in PCR (specificità e curva di melting)
2. Devo preparare concentrazioni cellulari a titolo noto
da cui estrarre e dosare il DNA totale
 108 cellule
125 ng
 106 cellule
10 ng
 104 cellule
0.9 pg
3. Devo sottoporre ciascun campione ottenuto a q-PCR
per ottenere delle curve di calibrazione, per trovare il
range di linearità e la corrispondenza tra:
CT : quantità di DNA :
quantità di cellule
A QUESTO PUNTO POSSO ANALIZZARE LA
MATRICE IN ESAME
 Estraggo il DNA totale dalla matrice ed
eseguo una real-time PCR utilizzando tutti i
dati ottenuti in fase di messa a punto del
metodo:
 primers specifici
 curva di calibrazione
Quantitativa relativa
Plot di amplificazione
Control
Sample
Numero di cicli
CT
Studio dell’espressione genica
1. Primers specifici per amplificare il gene di interesse
2. Estrazione dell’RNA e Real-time PCR per valutare
se il gene viene trascritto
L’ RNA estratto deve venire
retrotrascritto in DNA
=REVERSE TRANSCRIPTASE PCR
La RT-PCR amplifica un RNA convertendolo prima in DNA (o
DNA omplementare all’RNA) tramite l’enzima trascrittasi
inversa, e poi amplificandolo tramite PCR con primers specifici
per la sequenza di interesse.
Estrarre l’RNA totale dal campione biologico
che si vuole
esaminare
Trasformare il pool di RNA (che conterrà
anche l’mRNA
trascritto dal gene di interesse) in cDNA
tramite la reazione di
trascrizione inversa
Evidenziare il cDNA di interesse tramite la
reazione di PCR
Quantitativa relativa: analisi dei dati
 Normalizzare il gene target con un controllo endogeno
(ref) espresso costitutivamente (CT) in una condizione
di controllo
 Variare le condizioni di crescita del ceppo in esame ed
eseguire l’analisi. Il controllo endogeno non dovrebbe
variare. La variazione di espressione del gene in studio
va valutata in riferimento all’espressione dello stesso
gene nelle condizioni di controllo
 Comparare ciascun CT così ottenuto con il CT del
controllo
ratio = ( Etarget)ΔCt target (control-treated)
(Eref)ΔCt ref (control-treated)
E = efficienza della reazione: in teoria ad ogni ciclo di
amplificazione si ha raddoppio delle copie di DNA
 Il valore così ottenuto permette di determinare la
concentrazione relativa del target