Real Time PCR
La PCR Real Time è in grado di misurare in tempo reale la
concentrazione iniziale di una sequenza target in un campione
biologico.
Gli strumenti per PCR Real Time, oltre a fungere da termociclatori,
eccitano i fluorocromi presenti nei campioni e convogliano quindi la
fluorescenza emessa in risposta fino ad uno spettrografo.
Appositi software acquisiscono lo spettro di emissione di ogni
singolo campione per tutta la durata della PCR e convertono la
variazione di fluorescenza del reporter in una rappresentazione in
tempo reale della cinetica d’amplificazione.
Il calcolo della quantità di DNA dei campioni incogniti viene
effettuata determinando il ciclo della PCR (ciclo soglia, Ct) in cui
viene raggiunto il valore soglia di fluorescenza del reporter e dove
cioè i segnali di amplificazione specifici sono separabili da quelli
del rumore di fondo del sistema.
Fluorescenza
Il numero dei cicli necessari perché un campione raggiunga il suo
Ct è inversamente proporzionale al numero di copie target presente
inizialmente.
Cicli di amplificazione
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Il vantaggio in termini di precisione e di intervallo di
quantificazione rispetto alle PCR tradizionali, è dovuto alla
possibilità di quantificare il DNA al ciclo soglia, che è sempre
calcolato nella fase esponenziale della reazione PCR, fase in
cui i reagenti sono ancora lontani dall’esaurimento e gli
elementi di variabilità sono così ridotti al minimo.
SYBR Green: principio
SYBR Green I
Utilizza una molecola fluorescente non specifica che si lega al solco
minore del DNA
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SYBR Green
All’inizio del processo di amplificazione, la miscela di reazione
contiene DNA denaturato, primers e la molecola fluorescente
SYBR Green
Dopo l’annealing dei primers, si legano poche molecole
fluorescenti alla doppia elica.
SYBR Green
Durante l’elongazione si verifica un aumento di fluorescenza che
corrisponde all’ aumento del numero di copie dell’amplicone
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SYBR green
• Metodica semplice
Possono essere utilizzati primers in uso in qualitativa
• Non costosa
• Non-specifica
– La molecola fluorescente si lega random a tutte le
d opp ie elich e, includ endo i dim eri d i p rim ers
– È necessario ottimizzare la metodica per evitare la
formazione di prodotti aspecifici
In seguito sono state utilizzate delle sonde caratterizzate dal
fatto di essere un oligonucleotide dotato sia di un fluorocromo
“reporter” che di un “quencher”.
Quando la sonda è intatta, la fluorescenza del reporter è spenta
dalla vicinanza del quencher; ma quando la sonda è rotta dalla
Taq polimerasi, l’attività dei fluorocromi viene rilevata.
Uno dei saggi più diffusi per PCR real-time è il sistema
“TaqMan”, il quale utilizza una sonda contenente due
fluorocromi: FAM (6-carboxy-fluorescein) come reporter
fluorescente legato covalentemente all’estremità in 5’ e TAMRA
(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine) come quencher fluorescente
legato covalentemente all’estremità in 3’.
Se è avvenuta l’ibridazione, l’attività 5’ esonucleasica della Taq
polimerasi rompe la sonda interna durante la fase di estensione,
emettendo un segnale di fluorescenza.
La possibilità di utilizzare vari tipi di fluorocromi per marcare
sonde diverse consente di rilevare contemporaneamente più di
una sequenza target in una sola reazione, realizzando così una
reazione in multiplex.
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Sonda TaqMan
Presenta all’estremità 5’ un fluoroforo “Reporter” ed all’estremità 3’
una molecola“Quencher”
5’
3’
Reporter-Quencher
5’ REPORTER (R): fluorocromo ad alta energia che emette
fluorescenza
3’ QUENCHER (Q): fluorocromo a bassa energia che spegne la
fluorescenza del reporter
R
Q
5’
3’
Se R e Q si trovano vicini, Q spegne l'effetto di R perchè i fotoni
di R vengono assorbiti da Q
Real-Time PCR:
attività 5’>3’ esonucleasica
R
5’
Q
3’
5’
3’
R
Q
5’
5’
3’
R
Q
5’
3’
5’
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L’aumento di fluorescenza del Reporter è direttamente
proporzionale al numero di ampliconi generati
Forward primer
Probe
Reverse primer
Real-Time PCR: la reazione
COMPONENTI DELLA REAZIONE:
1) DNA target
2) DNA polimerasi
3) Due oligonucleotidi
4) dNTPs
5) Probe fluorescente
Run RealReal-Time thermal cycle
50 cycles
95°C
3 min
Activates
Amplitaq Gold
15 s
65°C
55°C
50°C
1 min
30 s
2 min
Activates
UNG (Uracile N-Glicosilasi)
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Sonde FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
Simili alle sonde TaqMan perché si legano al DNA
bersaglio e vengono idrolizzate, ci sono però
due sonde ognuna marcata con un solo
fluorocromo (accettore e donatore)
Quando le sonde non sono legate alle sequenze
target il segnale fluorescente proveniente
dall'accettore non è rilevato
donatore
accettore
Durante lo step di annealing PCR, entrambe le
sonde FRET ibridizzano alle sequenze target:
ciò avvicina il fluoroforo donatore all'accettore
permettendo il trasferimento di energia tra i due
fluorofori e la produzione di un segnale
fluorescente da parte dell'accettore che viene
rilevato.
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