Retrotrascrizione
l’mRNA viene convertito in cDNA per mezzo
dell’enzima trascrittasi inversa (DNA polimerasi RNAdipendenti ricavate dai virus della mieloblastosi aviaria
AMV o della leucemia murina di moloney MuLV) in
presenza di nucleotidi e di un singolo primer.
Il primer utilizzato può essere specifico per il gene che
si intende amplificare oppure aspecifico (oligo (dT)
oppure random esameri).
1
Il risultato della reazione di retrotrascrizione produce
degli ibridi RNA-DNA.
Per clonare le molecole di cDNA, le catene di RNA
devono essere distrutte e sostituite da DNA.
Un metodo per far ciò consiste nell’uso di RNasi H,
che taglia l’RNA negli ibridi; oppure L’RNA viene
allontanato dal DNA per semplice denaturazione
ottenuta con riscaldamento.
Il cDNA fa poi da stampo nella successiva reazione di
riamplificazione (PCR classica) in cui si utilizzano
primers gene specifici (oppure un primer specifico ed
un primer aspecifico).
2
PCR
DNA polimerasi: enzima capace di produrre una catena di
DNA complementare ad una catena a singolo filamento.
Necessita di uno stampo e di un innesco con un 3’-OH
libero.
La PCR (reazione a catena della polimerasi) consente
l’amplificazione di un frammento di DNA specifico a partire
da una minima quantità di DNA stampo.
La reazione richiede: uno stampo di DNA, una miscela di
nucleotidi e due inneschi (primers) che definiscono i punti
di inizio della sintesi del DNA.
Se si parte da DNA a doppio filamento è necessario
separare le catene perché i primers possano poi
legarsi alla zona a loro complementare.
La PCR, quindi, consiste nel ripetersi di cicli in cui si
fa variare la temperatura:
a) denaturazione (94-95°C) rottura dei legami
idrogeno e separazione dei filamenti
b) appaiamento (T specifica) i primers legano la
catena nella zona a loro complementare
c) estensione (T ottimale per la polimerasi in uso)
produzione dei frammenti
Alla fine di x cicli di PCR, il prodotto viene controllato:
tramite gel di agarosio oppure tramite
sequenziamento ed utilizzato.
3
Scelta dei primers: la scelta dei primers viene effettuata
seguendo alcuni criteri:
a) devono avere una lunghezza compresa tra 17 e 30
nucleotidi
b) la percentuale di GC ideale è del 50%; se il contenuto
di GC è più basso sii devono usare primers lunghi per
evitare Tm troppo basse
c) evitare sequenze che contengano lunghe ripetizioni di
singoli nucleotidi (più di 3-4)
d) i primers non dovrebbero presentare strutture
secondarie significative
e) i primers non devono presentare complementarietà
tra loro
Scelta dei Primers
1) Cercare la sequenza del gene di interesse in banca dati
2) Identificare inizio e fine dell’ORF (se si vuole clonare la porzione codificante)
3) Scrivere sequenza dei primers cercando di rispettare le regole dette
Ad esempio
>AK057661
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
1081
1141
1201
1261
1321
agtcgcggct
aggttgggca
gtgccctggc
tgatagtaga
ttggatggag
gatccatttg
gaaaaagccc
cttccagagc
aggagttgca
ttgatcaggc
agtacattgc
aacacctttg
tgatgcaaca
agagattgct
catttcagcc
aagaacaagc
ttcttagtcc
gaagttctgg
atcatgccct
ttagttttag
ttctaggggt
tttactgaaa
agatcagata
gcgagatttg
ggcttctctg
ctctggtctg
tattgcaaga
cttgggaaga
aaccacagcg
ttgtagagca
agctgctttc
ggctttagat
cagcttagac
agcaaagcta
tacgatcata
actagatgta
acacaaacaa
tgcggaggag
tgtttcccca
aaactgccca
tattcttttg
gacctccaat
taaattaata
atgtttcacc
gtaagtgact
aatatagaaa
ggcacttttg
aggaggaact
actccagtag
acttgcttca
tttcacaaag
acgtctcccc
aagccaaaaa
agcaccaaaa
gacatggtgt
tattcatacg
gatatacagc
cagcaaaatg
gaagccgatg
gaagtagaat
agtgtgacat
aaggtagatg
aatcaagaag
agctaatatg
aaaaacctct
ggtttggcca
ttgattttgg
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ttagagaggc
agaaagtgtc
agcatcccct
ttggccacat
tttgcagtag
gaattcatga
ataactgtat
gtttaccctt
gagtgttttt
gttaaactca
4
Se possibile la miscela di reazione va preparata in
ghiaccio o si devono utilizzare Taq (es. AmpliTaq
Gold) modificate che sono in grado di partire solo
dopo essere state portate a 95°C. In tal modo si ce rca
di minimizzare il rischio che i primer annilino a regioni
non desiderate.
Nested PCR: per ridurre il rischio di aspecifici si
ricorre alla nested PCR. In questo caso il prodotto di
una prima reazione di PCR viene usato come stampo
per una seconda razione in cui si usano
oligonucleotidi posti più internamente rispetto alla
coppia iniziale.
Polymerase chain reaction (PCR)
Consente l’amplificazione
del DNA stampo.
A. applicazioni
B. Componenti della reazione
C. procedura
5
A. PCR applicazioni
Amplificazione del DNA
per
clonaggio di geni
mutagenesi
amplificazione di sequenze
B. PCR componenti della reazione
stampo (~104 molecole)
DNA polimerasi termostabile
(Taq or Pfu polimerasi)
2 DNA primers (1017 molecole)
4 deossinucleotidi
tampone
I 2 primers legano il DNA su
filamenti opposti
primers
stampo
Riscaldamento: separa I filamenti
Raffreddamento: appaiamento dei
primers
5'
5'
Primer #1
Primer #2
6
C. procedura
1. denaturare il DNA stampo
stampo
primers
DNA
polimerasi
Denaturaz. a 94°C
2 appaiamento dei primers
appaiamento a ~ 50ºC
primers legano la regione complementare
3. estensione utilizzando la DNA
polimerasi
estensione a 72ºC
4. ripetizione steps 1-3, ~ 35 volte (35 cicli)
7
secondo ciclo
denaturazione
secondo ciclo
appaiamento
secondo ciclo
estensione
8
35 cicli
stampo
Prodotto finale
I primers sono incorporati nel prodotto
Prodotto ottenuto da I molecola di stampo
= (quantità di stampo) x 2 (numero di cicli)
= (1) x 235 = 3.4 x 1010 molecole
34,000,000,000
Real Time PCR
La PCR Real Time è in grado di misurare in tempo reale la
concentrazione iniziale di una sequenza target in un campione
biologico.
Gli strumenti per PCR Real Time, oltre a fungere da termociclatori,
eccitano i fluorocromi presenti nei campioni e convogliano quindi la
fluorescenza emessa in risposta fino ad uno spettrografo.
Appositi software acquisiscono lo spettro di emissione di ogni
singolo campione per tutta la durata della PCR e convertono la
variazione di fluorescenza del reporter in una rappresentazione in
tempo reale della cinetica d’amplificazione.
9
Il calcolo della quantità di DNA dei campioni incogniti viene
effettuata determinando il ciclo della PCR (ciclo soglia, Ct) in cui
viene raggiunto il valore soglia di fluorescenza del reporter e dove
cioè i segnali di amplificazione specifici sono separabili da quelli
del rumore di fondo del sistema.
Fluorescenza
Il numero dei cicli necessari perché un campione raggiunga il suo
Ct è inversamente proporzionale al numero di copie target presente
inizialmente.
Cicli di amplificazione
Il vantaggio in termini di precisione e di intervallo di
quantificazione rispetto alle PCR tradizionali, è dovuto alla
possibilità di quantificare il DNA al ciclo soglia, che è sempre
calcolato nella fase esponenziale della reazione PCR, fase in
cui i reagenti sono ancora lontani dall’esaurimento e gli
elementi di variabilità sono così ridotti al minimo.
10
SYBR Green: principio
SYBR Green I
Utilizza una molecola fluorescente non specifica che si lega al solco
minore del DNA
SYBR Green
All’inizio del processo di amplificazione, la miscela di reazione
contiene DNA denaturato, primers e la molecola fluorescente
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SYBR Green
Dopo l’annealing dei primers, si legano poche molecole
fluorescenti alla doppia elica.
SYBR Green
Durante l’elongazione si verifica un aumento di fluorescenza che
corrisponde all’ aumento del numero di copie dell’amplicone
SYBR green
• Metodica semplice
Possono essere utilizzati primers in uso in qualitativa
• Non costosa
• Non-specifica
– La molecola fluorescente si lega random a tutte le doppie
eliche, includendo i dimeri di primers
– È necessario ottimizzare la metodica per evitare la
formazione di prodotti aspecifici
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In seguito sono state utilizzate delle sonde caratterizzate dal
fatto di essere un oligonucleotide dotato sia di un fluorocromo
“reporter” che di un “quencher”.
Quando la sonda è intatta, la fluorescenza del reporter è spenta
dalla vicinanza del quencher; ma quando la sonda è rotta dalla
Taq polimerasi, l’attività dei fluorocromi viene rilevata.
Uno dei saggi più diffusi per PCR real-time è il sistema
“TaqMan”, il quale utilizza una sonda contenente due
fluorocromi: FAM (6-carboxy-fluorescein) come reporter
fluorescente legato covalentemente all’estremità in 5’ e TAMRA
(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine) come quencher fluorescente
legato covalentemente all’estremità in 3’.
Se è avvenuta l’ibridazione, l’attività 5’ esonucleasica della Taq
polimerasi rompe la sonda interna durante la fase di estensione,
emettendo un segnale di fluorescenza.
La possibilità di utilizzare vari tipi di fluorocromi per marcare
sonde diverse consente di rilevare contemporaneamente più di
una sequenza target in una sola reazione, realizzando così una
reazione in multiplex.
Sonda TaqMan
Presenta all’estremità 5’ un fluoroforo “Reporter” ed all’estremità 3’
una molecola“Quencher”
5’
3’
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Reporter-Quencher
5’ REPORTER (R): fluorocromo ad alta energia che emette
fluorescenza
3’ QUENCHER (Q): fluorocromo a bassa energia che spegne la
fluorescenza del reporter
R
Q
5’
3’
Se R e Q si trovano vicini, Q spegne l'effetto di R perchè i fotoni
di R vengono assorbiti da Q
Real-Time PCR:
attività 5’>3’ esonucleasica
R
5’
Q
3’
5’
3’
R
Q
5’
5’
3’
R
Q
5’
5’
3’
L’aumento di fluorescenza del Reporter è direttamente
proporzionale al numero di ampliconi generati
Forward primer
Probe
Reverse primer
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Real-Time PCR: la reazione
COMPONENTI DELLA REAZIONE:
1) DNA target
2) DNA polimerasi
3) Due oligonucleotidi
4) dNTPs
5) Probe fluorescente
Run RealReal-Time thermal cycle
50 cycles
95°C
3 min
15 s
Activates
Amplitaq Gold
65°C
55°C
50°C
1 min
30 s
2 min
Activates
UNG (Uracile N-Glicosilasi)
Sonde FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
Simili alle sonde TaqMan perché si legano al DNA
bersaglio e vengono idrolizzate, ci sono però
due sonde ognuna marcata con un solo
fluorocromo (accettore e donatore)
Quando le sonde non sono legate alle sequenze
target il segnale fluorescente proveniente
dall'accettore non è rilevato
donatore
accettore
Durante lo step di annealing PCR, entrambe le
sonde FRET ibridizzano alle sequenze target:
ciò avvicina il fluoroforo donatore all'accettore
permettendo il trasferimento di energia tra i due
fluorofori e la produzione di un segnale
fluorescente da parte dell'accettore che viene
rilevato.
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