PCR
regione di interesse
I°stepp
5’
3’
3’
5’
III°step
i filamenti vengono separati ed i
primers si appaiano
i filamenti vengono separati ed i primers si appaiano
5’
complementarietà al
primer 1
3’
primer 1
primer 2
3’
5’
3’
3’
5’
5’
i primers si estendono
5’
3’
complementarietà al
primer 1
complementarietà al
primer 2
3’
5’
II°step
i filamenti vengono separati ed i
primers si appaiano
3’
5’
5’
3’
complementarietà al
primer 2
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
Frammenti desiderati
(quelli di lunghezza variabile non sono mostrati)
i primers si estendono
3’
5’
filamenti di lunghezza
variabile
5’
filamenti di lunghezza
omogenea
3’
i primers si estendono
E così via
5’-ATGGCTCAGTGGAACCAGCTGCAGCAGCTGGACACACGCTACCTGAAGCAGCTGCACCAGCTGTACAGCGA-
5’-ATGGCTCAGTGGAACCAG-3’
3’-TACCGAGTCACCTTGGTCGACGTCGTCGACCTGTGTGCGATGGACTTCGTCGACGTGGTCGACATGTCGCT-
-CACGTTCCCCATGGAGCTGCGGCAGTTCCTGGCACCTTGGATTGAGAGTCAAGACTGGGCATATGCAGCCA-3’
3’-TGACCCGTATACGTCGGT-5’
-GTGCAAGGGGTACCTCGACGCCGTCAAGGACCGTGGAACCTAACTCTCAGTTCTGACCCGTATACGTCGGT-5’
5’-ATGGCTCAGTGGAACCAG-3’
Tm=(No G+C)x4 + (No A+T)x2 = (10)x4 + (8)x2=56OC
5’-TGGCTGCATATGCCCAGT-3’
Tm=(No G+C)x4 + (No A+T)x2 = (10)x4 + (8)x2=56OC
PCR: amplificazione
n.ro cicli
n.ro sequenze bersaglio
1
0
3
2
10
256
15
8192
20
262.144
25
8.388.608
30
268.435.456
La sequenza bersaglio è la
sequenza di DNA sintetizzata
tra i due primers
Occorre ~1g di DNA per l’analisi di una sequenza o una digestione con enzimi di restrizione tali da poter
essere visibili in elettroforesi. Se vi sono ~5 pg di DNA/cellula umana (5x10-12g) allora ~1 g of DNA
potrebbe essere isolato da 200.000 cellule ma avremmo un miscuglio di tutti i geni.
In 1  g di DNA genomico, una copia singola di un gene (300 bp) equivarrebbe a ~0.1 pg di DNA.
Questo 0.1 pg di DNA potrebbe essere amplificato mediante PCR producendo 0.8  g in 25 cicli e 27  g in
30 cicli.
PCR
VANTAGGI:
• Sensibilita’
• Rapidita’
• Si presta all’analisi simultanea di molti campioni (high throughput)
• Si presta all’analisi simultanea di diverse sequenze sullo stesso campione
• Si presta all’analisi di DNA degradato o incluso in mezzi strani, o fissato
•
•
•
•
•
•
SVANTAGGI:
Sensibilita’ (rischio di contaminazioni-falsi positivi)
Variabile efficienza di amplificazione a seconda della sequenza
Richiede conoscenza di base delle sequenze da amplificare e messa a punto
per coppie di oligonucleotidi di innesco (primers)
Può sintetizzare frammenti relativamente corti
La sintesi è imprecisa e introduce errori nella sequenza (la Taq pol non
possiede attività 3’->5’ esonucleasica)
Diagnostica molecolare
In genere i metodi classici sono basati su tecniche immunochimiche
Gli Ab si formano dopo diverse settimane
La PCR permette di verificare la presenza di poche copie del virus prima ancora che si siano formati
gli anticorpi.
Medicina legale
regione a lunghezza ipervariabile (VNTR)
individuo A
individuo B
VNTR 1
cromosomi
omologhi
VNTR 2
• To save time, money, and materials, much work has gone into
developing procedures whereby test DNA can be "incubated" with a
combination of PCR primers for several different markers at one
time. Primers are designed to bind at only one spot in the genome
so that during the PCR each primer should be busily dissecting out
and amplifying its own marker exclusively.
• The task of sorting out the results at the end is facilitated by adding
various colored fluorescent tags to the fragments. Fluorescent
labeling of DNA fragments may be performed in several ways. The
most common method is to incorporate a fluorescent dye on the 5'end of a PCR primer so that during PCR amplification either the
forward or the reverse strand of DNA will be labeled.
• At the end of the PCR, the mixture will be run through a gel
electrophoresis slab or an array of microtubules each filled with a
gel. Since each amplified fragment has a discrete length that
depends on the number of repeat motifs, it will move through the gel
at a different rate. The colors of the fluorescent labels are
coordinated with the size ranges of the markers so that several
markers in the same size range can be run together, each labeled
with a different color
•
•
•
By comparing with the mobility rates of fragments of known lengths, it is possible to
determine the length in base pairs for each marker and thus by calculation, the number of
repeats which is the number that you will receive in your report.
In the tracing above, four different fluorescent labels have been used--green, blue, red, and
black (which was probably actually yellow which does not show up very well.) Two
different sets of markers are shown. The upper tracing represents the results of
multiplexing 19 different markers--each labeled by its DYS identification number. The
bottom tracing shows the results of nine of the markers in the upper trace. Notice, for
example, how the markers DYS389I and DYS388 are only distinguishable as two separate
markers because of their different colored fluorescence.
•
Also note that the height of the fluorescence peak for each marker is not an important
value as only primers are labeled--one per fragment no matter how long or short the
fragment. The location of the peak on the x axis represents the number of base pairs in the
fragment which is a function of the number of repeats. Basically, once the number of base
pairs in the fragment is determined, it is a matter of subtracting the number of base pairs in
the primer from the total length then dividing that number by the number of bps that make
up on marker motif. This is a bit of an oversimplification because some markers may be
made of more than one repeating pattern and some primers may actually be part of the
actual STR region. Nevertheless, the concept is the same. All measurements and
calculations are done by computer.
•
In most large labs, an instrument called an automated DNA sequencer is used to run the
gels and record the different colors. There's an ultraviolet laser built into the machine that
shoots through the gel near the bottom and scans side to side, checking for bands of
fluorescent colors to pass through its beam. It is possible to run as many as 96 samples
through the gel at one time! The ABI PRISM® 3700 DNA Analyzer shown at the right is,
according to the Applied Biosystems website, "a fully automated, multi-capillary
electrophoresis instrument designed for use in production-scale DNA analysis. It can
automatically analyze multiple runs of 96 samples, which enables 24-hour unattended
operation."
Applicazioni nella ricerca per
clonare nuovi geni
(in alternativa allo screening)
• ATVALDLHILNANLDPDQTGATSAVTAEG
•
PROBE
• PRIMER FORWARD
•
V
A
L
D
L
H I
• GTG GCG CTG GAC CTG CAC AT
•
A
A A
T
A
T
•
T
T
T
T
•
C
C C
C
•
TTA
TTA
•
G
G
DEGENERAZIONE 2304
Ingegnerizzazione di proteine
PROTEINE CHIMERICHE
Proteina B
Proteina A
Proteina chimerica
Si parte dai geni (cDNA) delle proteine
Designare i primers
Fare 2 PCR separate
Identificazione del sesso
• Amplificazione specifica di un segmento
del cromosoma Y
• Sesso di un bambino non ancora nato
• Analisi di reperti archeologici (spesso le
differenze anatomiche sono indistinguibili)
• Attenzione alle contaminazioni!!!
Mutagenesi: metodo basato su M13
Mutagenesi:metodo basato su PCR
Step 1
G
C
T
A
G
PCR
G
C
Step 2
PCR
C
Step 3
G
C
PCR
G
C
PCR con
+
Identificazione di una sequenza codificante
• Metodi informatici
–
–
–
–
Uso dei codoni
Giunzioni esoni/introni
Identificazione regioni di regolazione
Analisi per omologia
• Metodi sperimentali
–
–
–
–
Northern blot
Southern blot (zooblot)
Exon-trapping
………………
Figura 54 Giunzioniesono/introni
branch
site
intron
exon intron
A
AG GU AAGU
C
G
A C
CUGA U
C/U-rich NCAG G
20-50 bases
exon exon
A
AG G
C
exon
Northern blot
Southern blot
– STUDIO DELL’ATTIVITA’ DEL GENOMA
• Una visione globale del genoma e della sua attività deve
comprendere non solo l’analisi della sequenza, l’identificazione dei
geni, ma anche comprendere come esso opera all’interno delle
cellula specificando e coordinando i geni che devono essere
espressi in risposta alle condizioni fisiologiche. Questo aspetto
molto importante comprende lo studio del
– TRASCRITTOMA
– PROTEOMA
• TRASCRITTOMA
• Il trascrittoma comprende il pool di mRNA presente nella cellula in
un dato momento. Si comprende quindi che il tracrittoma può essere
formato da migliaia di mRNA.
•
•
•
•
•
I metodi più utilizzati per caratterizzare un trascrittoma sono:
-RT-PCR
-SAGE (analisi seriale dell’espressione genica)
-Microarray
-Differential dispaly
Differential display
PROTEOMICA
• Il proteoma comprende tutte le proteine
espresse nello stesso momento in una
cellula allo stesso tempo, incluse tutte le
isoforme e le modificazioni posttraduzionali.
• La proteomica si può dividere in:
– proteomica classica
– proteomica funzionale.
•
•
•
•
•
•
•
L’identificazione di tutte le proteine è importante per:
•Identificazione di nuovi bersagli proteici per farmaci
• Validazione dei bersagli
• Profilo d’azione dei farmaci
• “Farmaco-proteomica” (tossicologia in vivo)
• Comparazione tra tessuti malati e normali
• Comparazione tra tessuti malati e trattati
farmacologicamente
• • Studio delle modificazioni post-trascrizionali
• • Strategie integrate con la genomica
• I principali metodi che permettono lo
studio e l’identificazione di molte proteine
contemporaneamente sono:
•
elettroforesi bidimensionale
•
spettrometria di massa
•
protein microarray
Sorgente di ioni,
Analizzatore di massa che misura il rapporto carica/massa (m/z)
detector che registra il numero di ioni a ogni valore di m/z
Electrospray ionisation (ESI)
matrix-assisted laser desortion/ionisation (MALDI)
MALDI-MS – miscela di peptide semplice
ESI-MS - per campioni complessi