PCR ed applicazioni
La PCR (Polymerase Chain Reaction) ha rivoluzionato la
biologia molecolare e trovato vasta applicazione in aree di
ricerca disparate
ideata e messa a punto da Kary Mullis nel 1983 (Nobel per la
chimica nel 1993).
È un metodo attraverso cui una
sequenza di DNA può essere
amplificata esponenzialmente in vitro
in modo specifico.
Consente di superare uno dei
maggiori problemi che si incontrano
nell’analisi dei geni: bersagli rari
all’interno di complessi e vasti
genomi.
Molecola
iniziale
di DNA
La PCR offre la possibilità di produrre
un enorme numero di copie di DNA
senza ricorrere al clonaggio.
1
2
4
Numero di molecole di DNA
8
“Ingredienti” e condizioni di PCR
- oligonucleotidi innesco (~20 bp) complementari alle
regioni fiancheggianti la zona da amplificare: primer per
la polimerasi
-Enzima DNA-polimerasi 5’→3’ (termostabile)
-dNTP
-DNA stampo.
sia puro che sottoforma di campioni biologici (fettine istologiche, capelli,
colonie batteriche, ecc). La quantità iniziale di DNA richiesta per la PCR è
minima, in teoria, anche una singola molecola è sufficiente
- Condizioni saline (MgCl2 cofattore) e di pH adeguate
-Alternanza di fasi a diversa temperatura
1) denaturazione del DNA stampo
2) appaiamento dei primer
3) estensione dei primer da parte della polimerasi
20-40 cicli di amplificazione
Accumulo esponenziale dei frammenti di
amplificazione→
Legge esponenziale→ x(2n)
x= n° molecole DNA stampo iniziale; n= n° di cicli
= 1 ciclo di PCR
ad ogni ciclo il DNA bersaglio
raddoppia
•Enzyme
•primers
•Template DNA
•dNTP
•Buffer
Il profilo termico è impostato
in un thermal cycler
Pcr.exe
Il prodotto di reazione è
controllato per elettroforesi
Enzimi usati in PCR
La PCR è stata rivoluzionata dall’uso di DNA polimerasi termostabili derivate da
batteri termofili
Vantaggi
resistenza passaggi di denaturazione
specificità sintesi↑
1) Taq polimerasi estratta da Thermus aquaticus
Attività polimerasi (ed esonucleasi) 5’→3’
Freq di errore 1/104-1/105 bp
Attività adenosin trasferasi
2) Pfu polimerasi (da Pyrococcus furiosus)
Polimerasi-esonucleasi 5’→3’
Esonucleasi 3’→5’: correzione bozze→freq. errore inferiore
3) Enzimi ricombinanti (con caratteristiche modificate/migliorate)
Partenze “hot start”: un ingrediente essenziale è attivato/aggiunto solo dopo che mix ha
raggiunto 95°C→ ↑ resa e specificità PCR (es polimerasi bloccata da anticorpo)
Dimensione max amplicone ~2-10 kb
Primer per PCR
•Oligonucleotidi 20-30 bp
•Complementari all’elica senso ed antisenso (polarità opposte)
•GC ~ 50%
•Evitare sequenze ripetute e complementari tra i due primer
•T annealing ~45-60°C
•Programmi specifici per design di primer
5’-gagtggaccatcgaagataac-3’
3’-ggcgatgactggggcaggacta- 5’
Uso di primer mismatch
volutamente non perfettamente complementari al DNA bersaglio per:
•Introdurre siti di restrizione per clonaggio
•Mutagenesi
•Ricerca di sequenze omologhe e famiglie geniche (uso di primer degenerati)
Applicazioni della PCR
Le applicazioni sono molteplici in campi diversi: genetica molecolare,
medicina, archeologia, medicina forense, analisi di popolazioni, studi di
filogenesi, etc.
•Diagnosi di malattie genetiche (mutazioni per delezioni/inserzioni o puntiformi)
•Analisi di medicina forense (es DNA finger-print)
•Clonaggio dei prodotti di PCR
•Rilevare infezioni batteriche o virali
•Analisi dell’espressione genica (RT-PCR)
•Studi di evoluzione molecolare (filogenesi)
Clonaggio mediante inserzione di siti di
restrizione nell’amplicone target
sito EcoRI
PCR
EcoRI
BamHI
EcoRI
BamHI
Vector DNA
sito BamHI
EcoRI
BamHI
Vettore e prodotto di PCR tagliati con
gli stessi enzimi di restrizione e ligati
Recombinant vector
TA cloning di prodotti di PCR
PCR product
T
3’
3’
3’
3’
T
Vector DNA
Il TA cloning sfrutta l’attività
adenosil trasferasica delle
Taq polimerasi
Esempio di diagnosi di malattia genetica dovuta a delezione genica:
la sindrome di Waardenburg
Primer 1
Delezione 18bp
Gene umano Pax3
Primer 2
PCR su DNA genomico estratto
Elettroforesi dei prodotti di PCR
selvatico
156 bp
138 bp
mutante
La sindrome è autosomica
dominante ed è caratterizzata da
sordità e pigmentazione
anomala.
Alcuni tipi di sindrome sono
causati da mutazioni per
delezione sul gene Pax-3.
I primer sono disegnati sui lati
del sito di delezione:
la PCR produce un unico
amplicone più lungo nel wt, due
ampliconi di cui uno più corto
nel mutante eterozigote
Primer 1
retrotrascrizione
3’
PCR
5’
Primer 2
Nell’RT-PCR il materiale di partenza è l’RNA
Consiste in 2 step:
1) sintesi di DNA da RNA
2) amplificazione di DNA specifico mediante PCR
Applicazioni: studio dell’espressione genica
Scelta della metodologia
Tecniche coltura-dipendenti
PCR specie-specifica
Cellule
Multiplex PCR
ARDA, RAPD-PCR
Tecniche coltura-indipendenti
DGGE
RT-PCR
Identificazione di
DNA
Microrganismi
Scelta del gene “target”
Cromosomiale?
•16S rDNA
•eae
•stx1 ed stx2
•recA
•rpoB
Plasmidico?
•ropy
•geni per la virulenza
(esempio Shigella spp.)
Applicazioni della PCR per l’identificazione di:
Microrganismi patogeni
Microrganismi alteranti
Microrganismi virtuosi
E.coli O157:H7
Vibrio vulnificus
S. aureus
Pediococcus damnosus
Lactobacillus plantarum
Identificazione di E. coli O157:H7
geni “target” eae ed stx
Hb 101 funge da controllo negativo (eae-, stx1-, stx2-);
EDL 933 è il controllo positivo (eae+, stx1+, stx2+)
1
2
3
4
M
200 bp
150 bp
106 bp
Spano, G., Beneduce, Terzi, V., Stanca, M. and Massa, S. (2005), Letters in Applied
Microbiology, 5, 20-24.
Identificazione di V. vulnifus
gene “target” emolisina
1
2
3
4
5
6
M
controlli
Spano, G., Beneduce, L., Oliver, J. and Massa, S. (2006) unpublished results
Identificazione di S. aureus
gene “target” entA
16S
entA
Microrganismi alteranti
Identificazione di Pediococcus damnosus
gene “target” plasmidiale
Nested PCR e conferma del gene ropy
Primer 1
Primer 2
Primer 3
Primo prodotto
Primer 4
Secondo Prodotto
Attenti al plasmide!
Giraffa et al., 1998, J. Appl. Microbiol., 85, 411-416.
Oh my God, il plasmide è sparito!