End point PCR
vs
quantitative RealReal-Time PCR
PCR - Polymerase Chain Reaction
ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per
questo, il premio Nobel per la chimica (1993).
Questa tecnica, utilizzando i principi della
duplicazione del DNA,
permette di ottenere in poco tempo
notevoli quantità di materiale specifico
Polymerase Chain Reaction: Multiple PCR Cycles
2 copies
DNA
fragment
to be
amplified
Resa: 2n
4 copies
8 copies
Polymerase Chain Reaction: principio
Amplificazione selettiva in vitro di una
sequenza di DNA target
COMPONENTI DELLA REAZIONE DI PCR
PCR:
1) Sequenza di DNA target
2) DNA polimerasi termostabile (Termophilus
aquaticus,, Taq polimerasi)
aquaticus
polimerasi)
3) Due Primers
Primers,, oligonucleotidi sintetici (20(20-25 bp
bp))
complementari a sequenze fiancheggianti il tratto
di DNA da studiare
4) dNTPs
5) Ioni Mg++
Polymerase Chain Reaction: principio
CICLI TERMICI:
DENATURAZIONE
(94
(94--96
96°
°C)
ANNEALING
(50
(50--65
65°
°C)
EXTENSION
(72
(72°
°C)
END POINT PCR
Il campione si sottopone al numero di cicli stabiliti (30(30-40),
alla fine della reazione un’aliquota si sottopone ad
elettroforesi su gel di agorosio per verificare:
1. la lunghezza dell’amplificato (controllo del peso
molecolare in bp mediante ladder
ladder))
2. L’assenza di frammenti aspecifici
3. La quantità di amplificato ottenuto (proporzionale
all’intensità della banda)
PCR PHASES
L’amplificazione di ogni target è definita da 3 fasi:
1 – esponenziale; 2 – lineare; 3 – plateau.
All reagents are
present
Some of the
reagents start
wearing out
Cycle
All the
reagents
finished
PCR: effetto plateau
Il processo di duplicazione non procede “all’infinito”,
esso è limitato da:
Quantità dei primers
primers,, dNTP,
dNTP, MgCl2, Buffer
Attività della Taq polimerasi
Reannealing dei filamenti
Raggiunto il plateau non si osserva più un incremento nei
prodotti
La PCR end-point non
quantitativo ma qualitativo.
è
un
metodo
Alla fine della reazione non sempre la quantità
di DNA del campione d’origine è proporzionale
all’intensità della banda ottenuta.
Utilizzando particolari accorgimenti può
diventare un metodo semi-quantitativo.
Polymerase Chain Reaction:
vantaggi
1) Velocità e facilità d’uso
In poche ore si possono ottenere milioni di copie
della sequenza di DNA target
2) Sensibilità
Virtualmente è possibile utilizzare il DNA di una
singola cellula come template (contaminazione)
3) Robustezza
Amplificazione possibile anche utilizzando DNA di
bassa qualità
Polymerase Chain Reaction
Reaction::
svantaggi
1) Solo sequenze note
Necessario conoscere la sequenza del DNA da amplificare per
sintetizzare i primers.
2) Dimensioni e quantità limitate
Dimensioni medie dell’amplicone 0.1-5kb
Quantità limitata rispetto alle tecniche di clonaggio.
3) Proofreading
Taq polimerasi manca dell’attività 3’
3’→
→5’ esonucleasica,
esonucleasica, 20 cicli di
reazione su un frammento di 1 kb produrranno ∼40% di frammenti con
una mutazione puntiforme (∼
(∼1/10000).
4) Analisi in End Point ed effetto Plateau
Per analizzare il campione bisogna aspettare la fine della reazione;
raggiunta la fase di plateau la quantità di amplificato non è più
proporzionale alla concentrazione iniziale di campione.
campione.
Soluzioni
Utilizzare i dati ottenuti durante la fase esponenziale in cui il
prodotto di PCR è proporzionale al template iniziale
Questo è reso possibile mediante il rilevamento di una
fluorescenza il cui accumulo segue la stessa cinetica della
reazione di PCR e che
che,, quindi
quindi,, è proporzionale al prodotto di
PCR
Si utilizzano particolari termociclatori in grado misurare la
fluorescenza emessa da particolari fluorofori ad ogni ciclo.
ciclo.
Quantitative RealReal-time PCR
Quantitative RealReal-time PCR
Tecnica che consente la simultanea
amplificazione e quantificazione del DNA
target.
AMPLIFICAZIONE: prevede essenzialmente gli step
di una classica PCR
QUANTIFICAZIONE: effettuata aggiungendo composti la cui
fluorescenza emessa ad ogni ciclo di
reazione è proporzionale alla quantità di
amplificato.
Real-Time PCR: la reazione
COMPONENTI DELLA REAZIONE:
1) DNA target
2) DNA polimerasi
3) Due oligonucleotidi
4) dNTPs
5) Fluorocromo
Perché RealReal-Time?
Misura l'amplificazione in tempo reale durante la
fase esponenziale della PCR, quando cioè
l'efficienza di amplificazione è influenzata
m i n i m a m e n t e d a l l e v a r i a b il i d i r e a z i o n e ,
permettendo di ottenere risultati molto più
accurati rispetto alla PCR tradizionale "end point"
Chimiche fluorescenti
per PCR RealReal-Time
•La fluorescenza si genera durante la PCR per effetto di
diverse possibili reazioni chimiche
•Le chimiche principali sono basate sia sul legame di
coloranti fluorescenti che si intercalano al dsDNA, come il
SYBR Green, sia sull'ibridazione di sonde specifiche.
SYBR Green
SYBR Green:SYBR
principio
Green I
Utilizza una molecola fluorescente non specifica che si
lega al solco minore di tutte le molecole di dsDNA.
dsDNA.
SYBR Green
All’inizio del processo di amplificazione, la miscela
di reazione contiene DNA denaturato, primers e la
molecola fluorescente
SYBR Green
Dopo l’annealing dei primers, si legano poche
molecole fluorescenti alla doppia elica.
SYBR Green
Durante l’elongazione si verifica un aumento di
fluorescenza che corrisponde all’aumento del
numero di copie dell’amplicone
SYBR green
Metodica semplice
Possono essere utilizzati primers in uso in qualitativa
Non costosa
Non-specifica
Non La molecola fluorescente si lega random a tutte le
doppie eliche
eliche,, includendo i dimeri di primers
È necessario ottimizzare la metodica per evitare la
formazione di prodotti aspecifici
Curva di dissociazione
Dopo l'amplificazione, i campioni vengono riscaldati
e la variazione dell'energia di fluorescenza viene
monitorata per generare una curva di dissociazione
Curva di dissociazione
•T dissociazione proporzionale alla grandezza dell’amplimero
dell’amplimero..
•La presenza di una o più curve di dissociazione dipende dal fatto che la
popolazione di amplimeri sia omogenea o eterogenea.
•L’ampiezza del picco è proporzionale alla quantità di amplificato.
TaqMan
TaqMan
La Real
Real--Time PCR si può realizzare mediante l’impiego:
l’impiego:
coloranti intercalanti ( es
es.. SYBR green), che si legano
in
maniera
aspecifica
a
tutto
il
DNA
sonde ad ibridazione,, specifiche per il frammento di
interesse, marcate con molecole fluorescenti
Esistono diversi tipi di sonde:
Dual--labeled (come le sonde TaqMan)
Dual
Molecular beacons
Scorpion
Sonde FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
Sonde TaqMan
La sonda di tipo TaqMan è un oligonucleotide che, come i
primers della PCR, viene disegnato per essere
complementare alla sequenza bersaglio da amplificare
R
5’
3’
5’
Primer
3’
5’
Q
3’
5’
Primer
3’
5’
La sonda è disegnata in modo da ibridarsi all’interno
del frammento amplificato nella reazione di PCR
3’
Forward
Probe
Reverse
Sonda TaqMan
Presenta all’estremità 5’ un fluoroforo “Reporter”
ed all’estremità 3’ una molecola “Quencher”
5’
3’
Reporter--Quencher
Reporter
5’ REPORTER (R): fluorocromo ad alta energia che emette
fluorescenza
3’ QUENCHER (Q): fluorocromo a bassa energia che
spegne la fluorescenza del reporter
R
Q
5’
3’
Se R e Q si trovano vicini, Q spegne l'effetto di R
perchè i fotoni di R vengono assorbiti da Q
Reporter--Quencher
Reporter
Dye
Quencher
5,6 FAM
BHQ-1/TAMRA
HEX/JOE
BHQ-2
Texas Red/ROXBHQ-2
Cy5/Quasar670
BHQ-2 ( or-3)
6-carbossifluoresceina
6-carbossitetrametilrodamina
Real-Time PCR:
attività 5’>3’ esonucleasica
R
5’
Q
3’
5’
3’
R
Q
5’
5’
3’
R
Q
5’
3’
5’
L’aumento di fluorescenza del Reporter è direttamente
proporzionale al numero di ampliconi generati
Forward primer
Probe
Reverse primer
RT
RT--PCR quantitativa
•La fluorescenza emessa ad ogni ciclo di amplificazione
viene rilevata e analizzata tramite computer.
Plot lineare
Incremento di
fluorescenza
Cicli di PCR
Normalised reporter fluorescence (Rn)
Plot di amplificazione
Linea soglia scelta
d a l l ’ o p e r a t o r e
In maniera da intersecare
le curve di tutti i campioni
nella fase esponenziale
Indica il valore al di
sopra del quale
inizia l’accumulo di
un amplificato
E’ il ciclo della reazione di
amplificazione in cui il segnale
di fluorescenza del campione è
maggiore rispetto a quello
d e l l a T h r e s h o l d
PCR cycle number
Curve di amplificazione
Fluorescenza
Plot lineare
Cicli di amplificazione
Per ogni campione si ottiene una curva di amplificazione il
cui CT(=Threshold Cycle) è inversamente proporzionale alla
quantità di template iniziale
Quantificazione
ASSOLUTA
i campioni sono quantificati in modo assoluto
Necessita di standard di cui si conosce la concentrazione
assoluta (utilizzo di una standard curve)
Per tutti gli unknowns devono essere saggiate identiche
quantità di campioni
RELATIVA la quantificazione viene effettuata paragonando i CT
Necessita di controlli endogeni (non si utilizza una
standard curve)
Gli unknowns vengono “quantificati” paragonando il loro
∆CT con quello del controllo endogeno
Quantitativa assoluta
Ct
10 1
35
10 2
10 3
unknown sample
10 4
25
10 5
10 6
3500 copies
10 7
15
1
2
3
4
5
6
7
log10 template quantity
Il valore così ottenuto viene normalizzato rispetto a quello di un
gene espresso costitutivamente (β-actina, GAPDH, ATPs, β2 etc
etc))
Quantitativa relativa
Effettuata comparando i valori di Ct per determinare il
cambiamento di espressione di un gene target in un campione
rispetto ad un altro campione scelto come calibratore.
Plot di amplificazione
Control
Sample
Numero di cicli
∆CT
Quantitativa relativa
Per ogni esperimento in quantificazione relativa è necessario:
• TARGET – La sequenza di DNA da analizzare.
• CALIBRATORE – Il campione da usare come riferimento per l’analisi
comparativa (Trattato/non Trattato, campione al T0 in uno studio time course)
• CONTROLLO ENDOGENO – Un gene espresso costitutivamente in tutti i
campioni analizzati necessario per normalizzare i dati rispetto alla quantità di
DNA caricato e a variazioni di efficienza della reazione.
Quantitativa relativa: analisi dei dati
Normalizzare il target con un controllo endogeno (r)
espresso costitutivamente (∆CT)
Comparare ciascun ∆CT così ottenuto con il ∆CT di un
calibratore (cb) (∆∆
∆∆C
∆∆ T)
CT,r-- ∆CT,
CT,cb
cb)= 2- ∆∆CT
∆∆CT
2- (∆CT,r
Il valore così ottenuto permette di determinare la
concentrazione relativa del target
Step per il calcolo del 2-
∆∆CT
∆∆
CT
1.
Normalizzazione con un controllo endogeno (HK)
Ct gene interesse – Ct HK = ∆Ct
2.
Normalizzazione con il calibratore
∆Ct Campione – ∆Ct Calibratore = ∆∆Ct
3.
Applicare la formula
2-
∆∆CT
∆∆
CT
ESEMPIO
Campione
Ct HK
Ct gene terget
(IL-10)
Brain (calibratore)
14
32
Liver
16
28
Di quanto varia l’espressione dell’ IL-10 tra Liver e Brain?
1.
∆Ct Brain = 18
∆Ct Liver = 12
2.
∆Ct campione – ∆Ct calibratore = 12-18 = -6
3. 2-
∆∆CT
= 26 = 64
L’IL-10 è 64 volte più espressa nel Liver rispetto al Brain!