AMPLIFICAZIONE IN VITRO DEL DNA “REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)” PCR: reazione polimerasica a catena • Inventata da Kary Mullis negli anni ‘80 (premio Nobel 1993) • Serve per ottenere una grande quantita’ di una specifica sequenza di DNA in vitro • Puo’ amplificare un tratto di DNA per piu’ di 1 milione di volte ELEMENTI NECESSARI ALLA REAZIONE: 1- DUE OLIGONUCLEOTIDI COMPLEMENTARI A DUE REGIONI CHE SI TROVANO SU FILAMENTI OPPOSTI DEL DNA STAMPO AI LATI DELLA REGIONE CHE SI VUOLE AMPLIFICARE 2- DNA STAMPO CHE CONTENGA LA REGIONE DA AMPLIFICARE 3- POLIMERASI TERMOSTABILE (NON VIENE DENATURATA SE PORTATA A 95° C) 4- I 4 DESOSSINUCLEOTIDI TRIFOSFATI IL PROCESSO DI PCR PREVEDE UN CERTO NUMERO DI CICLI. OGNI CICLO CONSISTE DI 3 PASSAGGI: 1- DENATURAZIONE: TEMP. 95°C. IL DNA STAMPO VIENE DENATURATO, I DUE FILAMENTI SI SEPARANO 2-APPAIAMENTO: 55°C CIRCA. I PRIMERS SI APPAIANO CON IL DNA STAMPO 3- SINTESI: TEMP.72°C E’ OTTIMALE PER IL FUNZIONAMENTO DELLA Taq (Termus aquaticus) POLIMERASI PCR: Reazione a catena della polimerasi Metodo di amplificazione del DNA usando una polimerasi termostabile quale la Taq DNA polimerasi, uno stampo di DNA, un eccesso di primers e dideossinucleotidi (dNTP) in un buffer. PCR: Reazione a catena della polimerasi PCR: Reazione a catena della polimerasi PCR: amplificazione n.ro cicli n.ro sequenze bersaglio 1 0 3 2 10 256 15 8192 20 262.144 25 8.388.608 30 268.435.456 La sequenza bersaglio è la sequenza di DNA sintetizzata tra i due primers Occorre ~1g di DNA per l’analisi di una sequenza o una digestione con enzimi di restrizione tali da poter essere visibili in elettroforesi. Se vi sono ~5 pg di DNA/cellula umana (5x10-12g) allora ~1 g of DNA potrebbe essere isolato da 200.000 cellule ma avremmo un miscuglio di tutti i geni. In 1 g di DNA genomico, una copia singola di un gene (300 bp) equivarrebbe a ~0.1 pg di DNA. Questo 0.1 pg di DNA potrebbe essere amplificato mediante PCR producendo 0.8 g in 25 cicli e 27 g in 30 cicli. PCR VANTAGGI: • Sensibilita’ • Rapidita’ • Si presta all’analisi simultanea di molti campioni (high throughput) • Si presta all’analisi simultanea di diverse sequenze sullo stesso campione • Si presta all’analisi di DNA degradato o incluso in mezzi strani, o fissato • SVANTAGGI: • Sensibilita’ (rischio di contaminazioni-falsi positivi) • Variabile efficienza di amplificazione a seconda della sequenza • Richiede conoscenza di base delle sequenze da amplificare e messa a punto per coppie di oligonucleotidi di innesco (primers) Esempi di utilizzo della PCR • Su DNA: – segnalare la presenza o meno di sequenze specifiche (mutazioni, inserzioni virali, micro-organismo patogeni) > PCR DIAGNOSTICA – Amplificare frammenti specifici da usare in seguito come sonde oppure da “clonare” • Su RNA messaggero (RT-PCR): – segnalare la presenza di specifiche molecole di RNA (espressione genica, presenza di RNA di micro-organismi infettivi) – Amplificare frammenti specifici da usare in PCR/RFLP per l’analisi dell’anemia falciforme PCR/VNTR/STR in genetica forense Quale delle persone sospette può avere commesso il crimine? La tecnica PCR è utile, spesso necessaria, per amplificare il DNA estratto dai reperti trovati sulla scena del delitto. Si usano sonde multi-locus con molti alleli. Diagnosi di mutazioni mediante amplificazione allele-specifica Diagnosi genetica pre-impianto PCR utilizzata per rivelare uno specifico mRNA: PCR in seguito a trascrittasi inversa (RT-PCR) • Estrazione dell’RNA • Purificazione dell’RNA poliadenilato (mRNA) • Sintesi del cDNA con la trascrittasi inversa 3’ 5’ cDNA mRNA TTTTTTTT 5’ AAAAAAAA 3’ PCR utilizzata per rivelare uno specifico mRNA: PCR in seguito a trascrittasi inversa (RT-PCR) cDNA 3’ 5’ TTTTTTTT 5’ AAAAAAAA 3’ mRNA • Amplificazione della sequenza di interesse con oligonuceotidi di innesco specifici 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ • Analisi dei prodotti dell’amplificazione (elettroforesi) TTTTTTTT 5’ AAAAAAAA 3’ Number of molecules La PCR non e’ una tecnica quantitativa Number of cycles PCR quantitativa: RT-PCR in tempo reale • Utilizza particolari sostanze la cui fluorescenza si rivela quando intercalano la catena di DNA sintetizzata durante la reazione di amplificazione. • L’utilizzo di appositi apparecchi permette la misurazione della fluorescenza accumulata in tempo reale, proporzionale al numero di molecole amplificate e quindi al numero di molecole presenti in partenza Polymerase Chain Reaction: resa Log[DNA] • Resa teorica: 2n P=(2)n T Il prodotto (P) incrementa esponenzialmente con il numero di cicli di PCR (n) Il prodotto di PCR dipende da T,numero di copie di template di partenza Plateau Lineare Esponenziale Prodotto variabile N° cicli termici Polymerase Chain Reaction: plateau Resa effettiva: effetto plateau Il processo di duplicazione non procede “all’infinito”, esso è limitato da: Quantità dei primers Attività della Taq polimerasi Reannealing dei filamenti Raggiunto il plateau non si osserva più un incremento nei prodotti Soluzioni • Utilizzare i dati ottenuti durante la fase esponenziale I l p ro d o t t o d i P C R è p ro p o r z io n a le a l t e m p la t e in iz i a l e • Questo è reso possibile mediante il rilevamento, di una fluorescenza, che è p r o p o r z i o n a l e a l p r o d o t t o d i P C R • La fluorescenza, durante ogni ciclo di amplificazione, può essere rilevata utilizzando uno strumento quantitativo ma anche dei marcatori fluorescenti il cui accumulo segue la stessa cinetica della reazione di PCR RT-PCR convenzionale Reverse transcription Real-time RT-PCR Reverse transcription PCR reaction Nested PCR reaction Gel electrophoresis DNA sequencing Southern blot Manual or automated analysis PCR reaction Quantitative result Perché Real-Time? Misura l'amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR, quando cioè l'efficienza di amplificazione è influenzata minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati molto più accurati rispetto alla PCR tradizionale "end point" RT-PCR quantitativa •Rilevamento della fluorescenza associata all’amplificazione •Il prodotto di PCR non viene analizzato su gel di agarosio •Analisi del prodotto di fluorescenza tramite computer Plot lineare Incremento di fluorescenza Cicli di PCR Analisi tramite software Chimiche fluorescenti per PCR Real-Time •La fluorescenza si genera durante la PCR per effetto di diverse possibili reazioni chimiche •Le chimiche principali sono basate sia sul legame di coloranti fluorescenti che si intercalano nella doppia elica di DNA, come il SYBR Green, sia sull'ibridazione di sonde specifiche. SYBR Green SYBR Green:SYBR principio Green I Utilizza una molecola fluorescente non specifica che si lega al solco minore del DNA SYBR Green All’inizio del processo di amplificazione, la miscela di reazione contiene DNA denaturato, primers e la molecola fluorescente SYBR Green Dopo l’annealing dei primers, si legano poche molecole fluorescenti alla doppia elica. SYBR Green Durante l’elongazione si verifica un aumento di fluorescenza che corrisponde all’ aumento del numero di copie dell’amplicone SYBR green • Metodica semplice Possono essere utilizzati primers in uso in qualitativa • Non costosa • Non-specifica – La molecola fluorescente si lega random a tutte le doppie eliche, i n c l u d e n d o i d i m e r i d i p r i m e r s – È necessario ottimizzare la metodica per evitare la formazione di p r o d o t t i a s p e c i f i c i