Real-Time PCR o PCR Quantitativa
Valutazione dell’espressione di un gene:
Retrotrascrizione dell’RNA totale in cDNA
•
Amplificazione gene specifica del cDNA con Real-Time PCR
•
Valutazione del prodotto PCR ottenuto durante la fase esponenziale
Log [DNA]
•
Plateau
Lineare
Esponenziale
Prodotto
variabile
N° cicli
Real-Time PCR o PCR Quantitativa
Rilevamento della fluorescenza associata all’amplificazione con computer
Misurazione in tempo reale del prodotto di PCR ottenuto durante la fase
esponenziale, quando l’efficienza è infuenzata minimamente dalle
variabili di reazione
Il prodotto di PCR incrementa esponenzialmente con il numero di cicli (n)
e dipende dal numero di copie di stampo di partenza (T): P = (2)n T
Incremento di
fluorescenza
Real-Time PCR o PCR Quantitativa
Linea soglia scelta dall’operatore
In maniera da intersecare le curve
di tutti i campioni nella fase
esponenziale
CT = cycle
Threshold
E’ il ciclo della reazione di amplificazione in cui il
segnale di fluorescenza del campione è
maggiore rispetto a quello della Threshold
Fluorescenza
Real-Time PCR o PCR Quantitativa
Cicli di amplificazione
Per ogni campione si ottiene una curva di amplificazione il cui
CT(=Threshold Cycle) è inversamente proporzionale alla quantità di
campione iniziale
Plot di amplificazione
Numero di cicli
CT
Il valore così ottenuto viene normalizzato rispetto a quello di un gene espresso
c o s t i t u t i v a m e n t e (  - a c t i n a , G A P D H , H P R T, e t c )
Real-Time PCR o PCR Quantitativa
La fluorescenza si genera durante la PCR mediante l’impiego:
•La fluorescenza si genera durante la PCR per
- coloranti intercalanti ( es. SYBR green), che si legano in maniera
effetto di diverse possibili reazioni
aspecifica a tutto il DNA
c
h
i
m
i
c
h
e
- sonde ad ibridazione, specifiche per il frammento di interesse, marcate
con molecole fluorescenti
•Le chimiche principali sono basate sia sul
Quantificazione
assoluta:
i campioni
sono quantificati
in modo
legame
di coloranti
fluorescenti
che si
intercalano
doppia
elica di DNA, come il
assoluto, occorre
una nella
curva
standard
SYBR Green, sia sull'ibridazione di sonde
s p e c i f i c h e .
Quantificazione relativa: Confronto dei CT dei diversi campioni.
Il valore così ottenuto permette di determinare la concentrazione
relativa del target