La biologia molecolare nella
diagnostica virologica
Corso di perfezionamento
Nuovi sviluppi nella diagnostica microbiologica e
virologica
Diagnostica virologica
metodi diretti
definizione
Dimostrazione del virus o suoi
componenti
Tipo di metodo
Ricerca dei virioni al M.E.
Ricerca dell’infettività virale
Ricerca degli Ag virali
Ricerca del genoma virale
Ricerca delle sequenze nucleotidiche
Quali virus ?
difficilmente o non coltivabili
(HBV, HCV, papillomavirus, parvovirus B19)
a lento sviluppo
(CMV, BKV, JCV)
pericolosi da coltivare
(HIV)
emergenti
(TTV)
Ricerca delle sequenze nucleotidiche
Quando ?
campioni con la carica virale molto bassa
(liquor – HIV, HSV, JCV)
distinzione tra infezione latente e attiva
(CMV, HSV)
riduzione “periodo finestra”
(HIV, HCV)
monitoraggio delle infezioni croniche  valutazione prognostica
monitoraggi terapeutici
genotipizzazione
Ricerca delle sequenze nucleotidiche
Ibridazione
100 000 - 10 000 sequenze
bersaglio
amplificazione  ibridazione
10 - 1 sequenze bersaglio
Ibridazione degli acidi nucleici
reazioni bimolecolari fra una molecola bersaglio (target) e una
molecola sonda (probe), in cui catene complementari di acidi
nucleici si associano a formare molecole a doppia catena
Sonde (probes)
sequenze di DNA o di RNA complementari alla sequenza bersaglio
che si vuole cercare
•acidi nucleici purificati e clonati in vettori genetici
•oligonucleotidi di sintesi
• sonde generiche o specifiche
Sonde “calde”
dotate di un sistema di rivelazione
32P, 35S  visualizzazione dell’ibrido tramite autoradiografia
Sonde “fredde”
Fluorochromi
fluorescenza
Biotina
sistemi immunoenziamtici o enzimatici
Digossigenina
rivelazione colorimetrica o chemiluminescente
sistema di rivelazione
detection in gene probe assays:
(a) enzyme-labeled gene probe
(b) hapten-labeled gene probe detected with labeled anti-hapten antibody
(c) unlabeled gene probe and hybrid detection by means of anti-hybrid
antibody and labeled anti-species antibody
Sistema enzimatico
Sistema immunoenzimatico
Ibridazione
in soluzione
con successiva cattura dell’ibrido
su matrice solida membrana (dot-blot, gel-blot),
micropiastra
in situ
all’interno di cellule, con mantenimento
della morfologia cellulare e tessutale
Hybrid Capture II
ibridazione in fase liquida, cattura su pozzetto
rivelazione chemiluminescente
Denaturazione
Ibridazione
Cattura
Rivelazione
Acquisizione
HPV PROBE A: pool di sonde a RNA per HPV-LR: 6, 11, 42, 43 e 44
HPV PROBE B: pool di sonde a RNA per HPV-HR: 16, 18, 31, 33, 35,
39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 e 68
Sensiblità 1.000 copie
Ibridazione sul filtro (dot-blot)
32P autoradiografia
dig  coniugatoDigAP  X-fosfato + NTB
Rivelazione multicolore
Metodi di amplificazione
metodo
substrato
thermal cycling
PCR
target DNA
si
RT-PCR
target RNA
si
NASBA
target RNA
no
LCR
sonda
si
Q
sonda
no
bPCR
segnale
no
amplificazione del DNA target
Polymerase Chain Reaction (PCR)
amplificazione di una sequenza di DNA compresa tra due
brevi sequenze definite
Master mix
-
4 dNTP
-
DNA polimerasi termostabile
-
2 oligonucleotidi (primers)
•denaturazione
•appaiamento
•estensione
20-40 volte
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Rivelazione dei prodotti amplificati
• presenza della banda
• dimensioni della banda
• Conferma della specificità
- sequenziamento
- Southern blotting
- analisi con enzimi di restrizione
Rivelazione e identificazione di virus polio mediante
RT-PCR e tipizzazione mediante RFLP.
HaeIII
5 6 7 8
3
DdeI
1 2 3 4
2
DdeI
HaeIII
DdeI
HaeIII
1
M
480 pb
1: Sabin 1
2: Sabin 2
3: Sabin 3
4: “0” RNA
5: virus polio 1 di isolamento clinico
6: virus polio 2 di isolamento clinico
7: virus polio 3 di isolamento clinico
8: 20-100 pb ladder
1: Sabin 1
2: Sabin 2
3: Sabin 3
M: 20-100 bp ladder
Rivelazione dei prodotti amplificati
PCR/ELISA
ampliWell Parvo ID (Microgen)
sensibilità: 10 UI
standard internazionale (WHO):
1 UI  1 genoma
Possibilità di quantificare il prodotto
Rivelazione dei prodotti
amplificati
DEIA (Sorin Biomedica)
Rivelazione dei prodotti
AMPLICOR® Microwell Plate Test Format
Rivelazione dei prodotti
•sonde marcate con estere di acridinio (AE)
•reattivo di selezione idrolizza AE delle sonde libere
•La luce emessa da AE protetto rilevata con luminometro
Hybridization Protection Assay (Gene-Probe)
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Reazioni più comunemente usate nel laboratorio
diagnostico
•PCR singola
•PCR nested
•PCR multiplex
•RT-PCR
•Q-PCR (real time PCR)
PCR nested
amplificazione mediante 2 PCR consecutive:
maggiore specificità
maggiore sensibilità
Primer 1.1
1st Round PCR
Primer 1.2
Primer 2.2
2nd Round PCR
Primer 2.2
Amplification product
PCR multiplex
Identificazione di bersagli differenti in una sola reazione
• virus differenti
• sequenze differenti dello stesso virus
Duplex PCR per polyomavirus
umani BK e JC
RT-PCR
Trascrittasi inverse
•Moloney murine lekemia virus (M-MLV)
•Avian myeloblastosis virus (AMV)
•Tth DNA polimerasi
- attività di trascrittasi inversa
- attività di DNA polimerasi
amplificazione
• RNA virale genomico
• mRNA virali (non distingue tra DNA e RNA)
RT/PCR per VP1/ mRNA del parvovirus B19
1
100
Unità di mappa
B19/9
B19/9B
primers
B19/9
5’ GTT TTT TGT GAG CTA ACT AAC A 3’
B19/9B
5’ CCA CGA TGC AGC TAC AAC TT 3’
prodotti ottenuti: 131pb, 251pb, 1615pb
RT/PCR per VP1/mRNA del parvovirus B19
1
9
2
10
3
4
5
6
7
8
(1) MWM VI Roche; (2) cellule
non
infettate
(controllo
negativo); (3) tempo 0; (4) 24
ore ; (5) 48 ore; (6) 6 giorni;
(7,10) campioni bianchi; (8,9)
diluizioni
scalari
della
sequenza bersaglio clonata.
amplificazione del target RNA
Nucleic Acid Sequence – Based Amplification (NASBA)
prima reazione di amplificazione alternativa alla PCR (1989)
TAS = Transcription - based Amplification System
3SR o SSSR = Self Sustained Sequence Replication
amplificazione selettiva dell’RNA attraverso cicli ripetuti di
retrotrascrizione e di trascrizione
Primer antisenso 5’
utilizza 3 enzimi -
sequenza promotore per la T7 RNA polimerasi
trascrittasi inversa AMV
T7 RNA polimerasi
Rnasi H
Vantaggi (NASBA vs. RT/PCR)
•reazione isotermica
•sintesi selettiva del RNA: identificazione virus a RNA, identificazione
della riattivazione dei virus latenti
•può essere utilizzata in versione quantitativa
•elevata sensibilià e specificità
Nucleic Acid Sequence – Based Amplification NASBA
amplificazione della sonda
Ligase Chain Reaction (LCR)
Amplificazione di prodotti di ligazione complementari alla
sequenza bersaglio
Master mix
-
DNA ligasi termostabile
-
4 oligonucleotidi
-
DNA polimerasi (Gap-LCR)
•Denaturazione
•Appaiamento, ligazione
25 volte
Ligase Chain Reaction (LCR)
p1
p2
p3
p4
Ligase Chain Reaction (LCR)
Gap – LCR
amplificazione della sonda
Amplificazione con la Q Replicasi
Sonda
sequenza complementare alla sequenza bersaglio
+
Q RNA (MDV-1 RNA)
Enzimi
• replicasi Q = RNA polimerasi RNA dipendente in grado di
duplicare la molecola Q
• RNAsi III
amplificazione della sonda
Amplificazione con la Q Replicasi
ibridazione sandwich con una serie di sonde
- sonde di cattura (capture probes)
- sonde “leganti” (extender probes)
- sonde di amplificazione ramificate (bDNA probes)
- sonde marcate con enzima (reporter probes)
amplificazione del segnale
Branched chain DNA (bDNA)
•Non richiede la purificazione del campione
•Non soggetta alle contaminazioni
•Segnale generato dal prodotto della reazione
enzimatica è direttamente proporzionale alla carica
virale  applicazioni quantitative
Tecniche molecolari
Elevata sensibilità e specificità
vantaggi
Ricerca di virus difficilmente o non
coltivabili
Identificazione e tipizzazione
Quantificazione del prodotto
Facile automazione
Rapidità di esecuzione
Rischio di contaminazioni  falsi positivi
limiti
Rischio di cross-reazioni con acidi nucleici non specifici
Rischio di falsi negativi per inibitori
Alti costi