Separazione di frammenti di DNA (o RNA) di
diversa lunghezza tramite elettroforesi
Trasferimento secondo Southern (Southern blot)
Non necessariamente i polimorfismi di restrizione (RSP) sono legati a mutazioni patogeniche, ma
sono utili per caratterizzare alleli specifici
Altra forma di ibridazione su membrana: lo slot blot (sia con campioni di RNA che di DNA)
A
B
C
D
1
1
2
3
4
2
5
6
7
8
3
9
10
11
12
4
13
14
15
16
Slot blot
Altre forme di ibridazione: l’ibridazione in situ su cromosomi metafasici o interfasici
(FISH-fluorescence in situ hybridization)
Chromosome painting (verniciatura dei cromosomi)
Sonda: insieme di sequenze ripetute caratteristiche di un cromosoma
La FISH su cromosomi metafasici permette di evidenziare eventuali anormalita cariotipiche quali
traslocazioni, duplicazioni o polisomie
Sonda: grandi frammenti genomici (cloni di YAC, cosmidi o fagi)
Altre forme di ibridazione: l’ibridazione in situ su sezioni di tessuto
Campione: mRNA presente nelle diverse cellule del tessuto
Sonda: filamento anti-senso di uno specifico RNA
Trasferimento di RNA (Northern blot)
•
•
•
•
Estrazione dell’RNA
Separazione tramite elettroforesi su gel denaturante
Trasferimento su membrana
Promozione di legame covalente con la membrana (crosslinking)
• Ibridazione con sonda specifica
• Visualizzazione del segnale (autoradiografia o
colorimetria)
Quantificazione dell’RNA tramite Northern blot
Autoradiography of
Target
ctrl RNA
Gel colorato con
etidio bromuro
1,990
37,500 11,300 49,100
1
0.24
5.0
41,200 51,850 10,890
Tecnica dell’ibridazione dell’RNA (Northern)
• VANTAGGI:
– Quantitativa
– Provvede informazioni sul peso molecolare
• SVANTAGGI:
– Richiede molto lavoro e tempo
– Relativamente poco sensibile
– Limitata dalla capacita’ di legame della membrana
• ALTERNATIVE:
– RT-PCR
– IBRIDAZIONE DI MICRO- O MACRO-ARRAYS
Saggi di ibridazione standard e inversa
• STANDARD:bersaglio non marcato legato a supporto
solido, sonda marcata in soluzione
–
–
–
–
Southern blot
Northern blot
Colony o plaque lift
Ibridazione in situ su tessuto o su cromosomi
• INVERSA: sonda non marcata legata a supporto solido,
bersaglio marcato in soluzione
– Microarray o macroarray di DNA
– Microarray di oligonucleotidi
Sia i macroarrays che i microarrays sono stati sviluppati per soddisfare
l’esigenza di misurare contemporaneamente l’espressione di più geni.
Entambe le tecnologie si basano sullo stesso principio:
1. Come sonda si usano olgonucleotidi
o molecole di cDNA non marcati,
immmobilizzati in posizioni precise di
un supporto solido
A
B
C
D
1
a
b
g
d
2
e
z
h
q
3
i
k
l
m
4
n
x
o
Array
p
2. L’array viene ibridizzato con una
miscela complessa di molecole
marcate rappresentative
dell’mRNA espresso dalle cellule in
esame
mRNA
RT
Nucleotidi marcati
cDNA
Macroarray
• Le molecole sonda vengono legate a membrane di nylon
• Come tracciante viene utilizzata la radioattività
• Analisi di qualche decina o poche centinaia di geni
•Paragone tra l’intensita’ dei segnali ottenuti con campioni
marcati diversi
MICROARRAY A OLIGONUCLEOTIDI (tecnologia Affymetrix):
•Le molecole sonda sono oligonucleotidi sintetizzati direttemente su microchip
di silicio
• Su ogni microchip vengono sintetizzati fino a 400000 oligonucleotidi diversi.
•La metodica è stata sviluppata in modo da permettere misurazioni assolute
dell’abbondanza dei singoli mRNA
Microrray di cDNA (o di oligonucleotidi lunghi)
• Le molecole sonda sono cDNA o oligonucleotidi lunghi 70-80 paia di basi,
sintetizzati tradizionalmente e legati ad un vetrino da microscopio per mezzo
di un processo di stampa a getto (spotting)
• Su ogni vetrino trovano posto fino a 10000 geni.
•Si effettuano misurazioni comparative, non assolute
mRNA
Reverse
transcription
Labeled
1st strand cDNA
Sample 1 (test)
Sample 2 (reference)
Hybridization on the cDNA microarray
Attenzione !!!
L’enorme numero di geni analizzati dai
microarray è il punto più forte, ma anche più
debole della metodica. Infatti sono possibili
moltissimi errori (importanza di avere
campioni replicati), e il trattamento
dell’informazione non è banale! L’acquisizione
dei dati è solo la parte iniziale della procedura.
La parte più complicata è l’elaborazione della
enorme quantità di dati generati da questi
esperimenti, necessaria per rispondere ai
quesiti biologici di partenza. I dati più
significativi devono essere poi verificati con
altri sistemi (northern, real time RT-PCR)
Applicazioni
1. Definizione delle basi
molecolari e
identificazione di nuovi
markers prognostici per
neoplasie e altre patologie
2. farmacogenomica
Sequenziamento del DNA
Metodo enzimatico (Sanger)
Si eseguono 4 reazioni di
polimerizzazione separate
Sequenziamento del DNA
Metodo enzimatico (Sanger)
Amplificazione di una sequenza di DNA tramite la
reazione polimerasica a catena (PCR)
PCR
VANTAGGI:
• Sensibilita’
• Rapidita’
• Si presta all’analisi simultanea di molti campioni (high throughput)
• Si presta all’analisi simultanea di diverse sequenze sullo stesso
campione
• Si presta all’analisi di DNA degradato o incluso in mezzi strani, o
fissato
• SVANTAGGI:
• Sensibilita’ (rischio di contaminazioni-falsi positivi)
• Variabile efficienza di amplificazione a seconda della sequenza
• Richiede conoscenza di base delle sequenze da amplificare e messa a
punto per coppie di oligonucleotidi di innesco (primers)
• Può sintetizzare frammenti relativamente corti
• La sintesi è imprecisa e introduce errori nella sequenza(la Taq pol non
possiede attività 3’->5’ esonucleasica)
Esempi di utilizzo della PCR
• Su DNA:
– segnalare la presenza o meno di sequenze specifiche (mutazioni,
inserzioni virali, micro-organismo patogeni) -> PCR DIAGNOSTICA
– Amplificare frammenti specifici da usare in seguito come sonde
oppure da “clonare”
• Su RNA messaggero (RT-PCR):
– segnalare la presenza di specifiche molecole di RNA (espressione
genica, presenza di RNA di micro-organismi infettivi)
– Amplificare frammenti specifici da usare in seguito come sonde
oppure da “clonare” - isolare cDNA specifici per determinati geni.
PCR utilizzata per rivelare uno specifico mRNA:
PCR in seguito a trascrittasi inversa (RT-PCR)
•
•
•
•
Estrazione dell’RNA
Purificazione dell’RNA poliadenilato (mRNA)
Sintesi del cDNA con la trascrittasi inversa
Amplificazione della sequenza di interesse con
oligonuceotidi di innesto specifici
• Analisi dei prodotti dell’amplificazione (elettroforesi)
RT-PCR utilizzata per quantificare uno specifico
mRNA
• Reazione analizzata a compimento :
– PCR non competitiva (semiquantitativa-controllo interno)
– PCR competitiva (utilizza un competitore interno o MIMIC)
• Reazione analizzata in tempo reale :
– Utilizza l’amplificazione specifica con oligonucleotidi
fluorogenici. L’amplificazione puo’ essere seguita mentre avviene,
eliminando l’appiattimento dei risultati dovuto al raggiungimento
della saturazione. L’intensita’ della fluorescenza misurata
corrisponde alla quantita’ di prodotto amplificato.
RT-PCR in tempo reale
• Utilizza particolari combinazioni di coloranti fluorescenti
accoppiati agli oligonucleotidi, la cui fluorescenza viene
smascherata quando l’oligonucleotide e’ incorporato nella
catena di DNA sintetizzata durante la reazione di
amplificazione.
• L’utilizzo di appositi apparecchi permette la misurazione
della fluorescenza accumulata in tempo reale,
proporzionale al numero di molecole amplificate e quindi
al numero di molecole presenti in partenza
I prodotti di PCR possono essere clonati:
Uso della PCR per mappare, evidenziare e caratterizare
mutazioni note o meno:
• Amplicazione e sequenziamento delle sequenze codificanti un
determinato gene
• Rilevazione dei polimorfismi per i siti di restrizione
• Amplificazione allele-specifica
• Camminare lungo il genoma per individuare geni mutati
La PCR può essere utilizzata per lo screening di mutazioni geniche,
a partire sia da DNA genomico che da RNA
La PCR può essere utilizzata per l’analisi di polimorfismi per i siti di restrizione
(RFLP)
Amplificazione allele-specifica
(ARMS – amplification refractory mutation system)
Chromosome walking: