Flusso delle informazioni biologiche
DNA
RNA
Proteine
In ogni istante della propria vita ogni cellula umana contiene:
•46 cromosomi (20.000 geni)
•10-15.000 mRNA diversi
Hanno tutte lo stesso genoma, perché queste cellule
sono così diverse in morfologia e funzione?
Fegato
Corteccia cerebrale
Muscolo liscio
Perché esprimono geni diversi
ESPRESSIONE GENICA
E’ un processo molto complesso e
finemente regolato che permette ad
una cellula di rispondere
dinamicamente sia agli stimoli
ambientali che alle sue stesse
necessità di cambiamento
Misurare l’espressione di un gene significa....
Dare una valutazione quantitativa della
presenza dei trascritti (molecole di mRNA) o
delle proteine codificate da quel gene nelle
cellule in esame
Rapidi miglioramenti nella misurazione
dell’espressione dei geni
I microarray possono misurare l’espressione
di tutti i geni noti in poche ore
Misurare il trascrittoma
Trascrittoma
L'insieme di RNA messaggeri
espressi da ogni cellula
Proteoma
L'insieme di proteine espresse
da ogni cellula
Espressione genica differenziale: valuta
le differenze nell’espressione genica tra
due trascrittomi
cellule trattate con un composto
confronto
con cellule non trattate
un tessuto tumorale
a confronto
con uno sano
Composto
esogeno
esogeno
a
Tecnologia dei microarray
Sfrutta la capacità di una data molecola
di mRNA di ibridizzare con il DNA
stampo da cui è stata generata
Campione 1
Campione 2
RNA
Cy5
cDNA
Cy3
+
Acquisizione dell’immagine mediante scanner
Cy3
Cy5
L’intensità della fluorescenza è proporzionale alla quantità
di molecola target nella soluzione e, quindi, costituisce
una stima della quantità di RNA per ciascun gene
espresso dalla cellula.
Tipico esperimento Microarray
Fonti di confondimento in un esperimento
microarray
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•
•
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•
Qualità dell’RNA estratto
Retrotrascrizione
Marcatura
Deposizione delle sequenze sul vetrino
Disomogeneità della superficie del vetrino
Ibridazione
Lavaggi
Acquisizione dell’immagine
REPLICHE SPERIMENTALI
Stesso RNA testato su due vetrini distinti
REPLICHE BIOLOGICHE
RNA proveniente da campioni simili ma distinti
Analisi computazionale dei dati
Validazione del risultato
mediante Real-Time PCR
L’espressione differenziale dei geni
“più interessanti” viene confermata
con una metodica alternativa