La Terminazione della Trascrizione
I geni batterici possiedono dei
terminatori della trascrizione.
I Terminatori sono sequenze
dell RNA che promuovono il
distacco dell RNA polimerasi
dal templato
Ne esistono di 2 tipi
-dipendenti da Rho
-intrinseci
I terminatori Rho-dipendenti
richiedono il legame della
RNA elicasi Rho
alla catena nascente di RNA
Rho si lega all RNA su uno
specifico sito di riconoscimento, ma
agisce al 3 di questo
I terminatori intrinseci non richiedono nessun cofattore per la
terminazione
La terminazione della trascrizione batterica puo essere
modulata:
Antiterminatori = Specifiche proteine che consentono alla
RNA polimerasi di continuare la trascrizione attraverso il sito di
terminazione
Attenuatori = Sequenze dell RNA che regolano la terminazione
della trascrizione di un operone successivamente al primo gene
trascritto
Il caso del fago lambda:
Cascata di geni
Infezione e attivazione del
genoma di Lambda
Geni precoci immediati:
N e cro
Geni precoci
Geni tardivi
Uno dei geni precocissimi (N) codifica per un
antiterminatore che consente alla polimerasi di procedere
oltre, trascrivendo cioe anche i geni precoci
Il ribosoma puo causare questo evento
L attenuatore batterico: il caso della
sintesi del triptofano
L operone trp e costituito da una regione leader
(che codifica per un piccolo peptide ricco in
triptofano) e da trpE che codifica per un enzima
della sintesi del triptofano. Le due regioni sono
separate da un ATTENUATORE.
In assenza del triptofano il trptRNA non puo essere caricato
sui ribosomi. Di conseguenza i
ribosomi stallano sulla regione
leader impedendo il corretto
ripiegamento dell RNA
In presenza di trp
In assenza di trp
La terminazione negli eucarioti
Le pol1 e pol3 hanno dei
terminatori della trascrizione.
I terminatori della pol1 sono
sequenze di DNA che legano una
proteina, la quale promuove il
distacco della pol1
I terminatori della pol3 sono
sequenze di poli-U nell RNA
La pol2 non ha terminatori, la terminazione avviene in modo
differente ed e connessa alla stabilita alla capacita di essere
tradotto dell RNA messaggero.
Gli mRNA dei Batteri vengono
tradotti durante il processo
trascrizionale, e vengono degradati
subito dopo
L attacco dei ribosomi all mRNA
avviene grazie ad una specifica
sequenza posta nel 5 UTR: la
sequenza di Shine-Dalgarno
L mRNA eucariotico codifica per una sola proteina: non ci
sono operoni
L mRNA e modificato alle due estremita : cap e poliA
Durante l allungamento la coda C-terminale della pol2 recluta gli
enzimi per la sintesi del cap
Il cap serve per l attacco ai ribosomi
Il cap viene legato dal fattore di inizio della traduzione
eIF4F che contatta anche il poliA tramite PAPB
Cap e poliA sono fondamentali per l inizio della traduzione
L uso delle strategie di regolazione della
terminazione da parte del virus dell AIDS
La trascrizione del genoma di HIV e regolata da un
evento di terminazione
Durante la fase latente la trascrizione viene
bloccata qui da un terminatore a forcina
L antiterminatore tat permette di permette alla polimerasi
di proseguire nella trascrizione del genoma di HIV
Cap e poliA proteggono gli mRNA dalle esonucleasi
Per essere degradati, gli mRNA decono essere de-adenilati e il cap
deve essere rimosso
Regolazione della stabilita del messaggero:
il caso del metabolismo del ferro
La Transferrina serve per far entrare il ferro nelle cellule
Spazio extracellulare
citoplasma
Membrana
cellulare
La Ferritina serve per bloccare l eccesso di ferro nelle cellule
Transferrina e Ferritina agiscono in modo opposto sulla
concentrazione di Ferro intracellulare
Il ferro citoplasmatico regola la traduzione degli mRNA per
Transferrina e Ferritina
Terminazione della trascrizione: il caso dell HIV
I geni eucariotici contengono introni
Gli introni vengono tagliati via dai complessi sliceosomali
Trascrizione in vitro
La trascrizione arriva alla fine del
gene di interesse…
Sito di aggancio per la polimerasi del fagoT7
Gene di interesse
T7
T7
+ T7 RNA polimersi e
NTPs
Vettore plasmidico
per la trascrizione
in vitro
La polimerasi si
aggancia al sito di inizio
(non richiede fattori
sigma) e inizia a
trascrivere
T7
…e continua fino a che sono
disponibili i nucleotidi, trascrivendo
tutto il plasmide, anche il proprio
sito di inizio
Il plasmide viene linearizzato
mediante taglio con l enzima di
restrizione EcoRI, posto al 3 del
gene di interesse
+T7 RNA polimerasi
e NTPs
EcoRI
La polimerasi si aggancia al sito
di inizio e inizia a trascrivere
La polimerasi trascrive il DNA fino alla
fine del gene di interesse…
…e precipita nel vuoto in
corrispondenza del sito di taglio,
ovvero si stacca per mancanza
del templato, rilasciando anche il
trascritto
T7
T7
T7