CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL
FARMACO
Adriana Maggi
BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE
2008/09
LEZIONE 1
Adriana Maggi
Via Balzaretti 9
[email protected]
Telefono 02-50318375
ORARIO RICEVIMENTO
STUDENTI: venerdì mattina
(9:00-12:00)
…IL MEDICO ADOPRERA’ BENE
LE MEDICINE QUANDO LUI CONOSCERA’
CHE COSA E’ OMO,
CHE COSA E’ VITA E COMPLESSIONE,
CHE COSA E’ SANITA’…
LA FARMACOLOGIA STUDIA I FARMACI E
LE INTERAZIONI CHE HANNO LUOGO TRA QUESTI
E GLI ESSERI VIVENTI
PER FARMACO SI INTENDE OGNI SOSTANZA DI
PROVOCARE IN UN ORGANISMO MODIFICAZIONI
FUNZIONALI MEDIANTE UNA AZIONE
CHIMICA O FISICA
IL FARMACOLOGO DEVE POSSEDERE CONOSCENZE:
SUI PRINCIPI ATTIVI
SULLA PATO-FISIOLOGIA GLI ORGANISMI
SUI QUALI I FARMACI AGISCONO
Biotecnologie Farmacologiche
applicazione delle conoscenze di biologia/biologia
molecolare nel disegno di nuovi farmaci
Farmaci biotecnologici





proteine umane
proteine modificate
anticorpi umanizzati
acidi nucleici
cellule
La rilevanza dei processi di regolazione
della espressione genica
nel disegno di nuovi farmaci
MECCANISMI DI REGOLAZIONE DELLA ESPRESSIONE GENICA
ESPRESSIONE GENICA IN PROCARIOTE
Nei procarioti lo stesso enzima (RNAP) catalizza la sintesi di tutti e tre gli RNA
a RNA polimerasi di procariote è un enzima di relativamente grandi dimensioni ed è formata
da 5 subunità (~400 kDa):
α2:le due subunità αalfa assemblano l’enzima e riconoscono i fattori di regolazione.
β: catalizza la sintesi di RNA
β': lega il DNA in modo non specifico.
ω: funzione non ben descritta
Per legare sequenze specifiche di DNA nel promotore dei geni bersaglio, l’enzima necessita
del fattore σ . La struttura della RNAP ha una cavità di 55 Å di lunghezza e 25 Å di diametro dove si
adatta con precisione il DNA a doppio filamento (20 Å ): la lunghezza della cavità è sufficiente per
riconoscere un numero di circa 16 nucleotidi.
La trascrizione in eucariota
RNA POLYMERASE IN EUKARIOTE
RNA polimerasi I per la sintesi di pre-rRNA 45S, che matura a 28 S, 18S
and 5,8S rRNA
RNA polymerase II per la sintesi dei precursori di RNAm e la gran parte degli
snRNA. Richiede i fattori di trascrizione per legare con
specificità il DNA bersaglio
RNA polymerase III per lasintesi dei tRNA, rRNA 5S e altri piccoli RNA che
si trovano nel nucleo e citoplasma.
Cloroplasti e mitocodri hanno altri tipo di RNA polimerasi.
Le dimensioni dei nucleosomi
sono di circa 260 kD
La polimerasi di eucariota è un enzima
con diverse subunità che raggiunge
le dimensioni di circa 500 kD
La polimerasi determina una alterazione della struttura
nucleosomi che non è permanente
Il promotore di geni di eucariota
Caratterizzato da alta variabilità
Promotori riconosciuti dalla Polimerasi II in genere
si trovano a monte del gene, hanno struttura modulare e
si contraddistinguono per variabilità e si estendono per
circa 200 pb (ad eccezione degli enhancers)
La polimerasi II riconosce i siti di “attacco” tramite
interazioni con altri “fattori” proteici
- fattori generali di trascrizione (ubiquitari)
- fattori di trascrizione inducibili
Roger Kornberg Nobel Price for chemistry 2006
In the figure: the transcriptional process depicted in 2001. Pol II in white;
DNA helix in blue and the growing RNA strand in red
Differenze significative tra promotore procariota e eucariota
L’inizio della trascrizione in eucariota richiede un considerevole
numero di proteine che riconoscono elementi in cis: si intende per
promotore tutta la regione che contiene questi moduli di riconoscimento
dei attori di trascrizione indispensabili per consentire la trascrizione
efficiente e propriamente controllata in termini di inizio
Generalmente la regolazione in eucariote è in positivo, esistono tuttavia
repressori anche in eucariote
Generalmente una unità trascrizionale di eucariota è costituita da un
singolo gene
Le polimerasi di eucariota sono enzimi composti da diverse subunità (814) e raggiungono le dimensioni di circa 500kD. La Pol II si caratterizza
per un dominio carbossi-terminale con sequenze amminoacidiche
ripetitive ricche di treonine e serine
TBP + 12 TAFs (TBP ass. factors)
TFIID recognizes TATA (Inr)
commitment
TFIIA; TFIIB; TFIIF
Pol II entry
TFIIE; TFIIH
Promoter clearence
TFIIF pol II binding
TFII H helicase and kinase
Bob Roeder
Lasker Award 2003
TBP lega il solco minore del DNA
Poiché nei nucleosomi le sequenze AT
nel solco minore si affacciano
all’interno della molecola, la presenza
di nucleosomi è incompatibile con
il legame di questo complesso
proteico
COMPLESSITA’ DEI PROMOTORI DI EUCARIOTA
COMPLESSITA’ DEI PROMOTORI DI EUCARIOTA
Si tratta di una sequenza di DNA in cui sono presenti diversi moduli:
TATA box a circa -30 pb dal sito di inizio della trascrizone importante
Per il corretto inizio della trascrizione
CAT box a circa –80 pb che determina l’efficienza del promotore
(CAAT). Lega: proteine della famiglia CTF, CP1 eCP2 , C/EBP, ACF.
GC box a circa –90 pb (GGGcGG) anche presente in multiple copie
E’ riconosciuto dal fattore SP1
Ottamero traget di proteine Oct
Enhancers es. SV40 due sequenze in tandem di 72 pb
Moduli specifici per fattori di trascrizione inducibili
UN ESEMPIO DI PROMOTORE DI EUCARIOTA COMPLESSO
Enhancer:
- sequenza di DNA dove sono presenti diversi
motivi strutturali riconosciuti da fattori che
attivano la trascrizione che stimolano la trascrizione
- funzionano anche a distanza dal gene trascritto
- funzionano in ambedue gli orientamenti
Il meccanismo con cui agiscono rimane non ben chiarito:
Ipotesi iniziali
cambiano l’intera struttura del templato
pongono il promotore in una posizione
conveniente (es. matrice nucleare
facilitano l’entrata dellla polimerasi
Aumentano la disponibilità di fattori di trascrizione nella
vicinanza del promotore di cui influenzano la trascrizione
Meccanismi di metilazione
del DNA e eredità epigenetica
Meccanismi di metilazione del DNA
e eredità epigenetica
Circa il 2-7% delle citosine nel DNA animale
subisce metilazione ad opera di specifici enzimi
che agiscono su sequenze palindromi:
5’ mCpG 3’
3’ GpCm 5’
ESPRESSIONE GENICA E’ GENERALMENTE
ASSOCIATA CON
DEMETILAZIONE
I GENI “HOUSEKEEPING” SONO ESPRESSI IN
MODO COSTITUTIVO E CONTENGONO
NEL LORO PROMOTORE MOLTE “ISOLE” CpG
NON METILATE
CpG islands are genomic regions that contain a high frequency of CG
nucleotides. In mammalian genomes, CpG islands are typically 3003,000 base pairs in length. They are in and near approximately 40% of
promoters of mammalian genes (about 70% in human promoters).
The "p" in CpG notation refers to the phosphodiester bond between
the cytosine and the guanine.
The usual formal definition of a CpG island is a region with at least
200 bp and with a GC percentage that is greater than 50% and
with an observed/expected CpG ratio that is greater than 60%.
Another recent study revised the rules of CpG island prediction in
order to exclude other GC-rich genomic sequences such as Alu
repeats. Based on an extensive search on the complete sequences of
human chromosomes 21 and 22, DNA regions >500 bp with a GC
content >55% and observed CpG/expected CpG of 0.65 were more
likely to be the true CpG islands associated with the 5' regions of
genes.
PROCESSI DI ACETILAZIONE E
DEACETILAZIONE SONO IMPORTANTI
NELLA REGOLAZIONE DELLA ATTIVITA’
DELLA CROMATINA
ESPRESSIONE GENICA E’ GENERALMENTE
ASSOCIATA CON
ACETILAZIONE
Acetylation of the lysine residues at the N terminus of histone proteins removes
positive charges, thereby reducing the affinity between histones and DNA. This
makes RNA polymerase and transcription factors easier to access the promoter
region. Therefore, in most cases, histone acetylation enhances transcription while
histone deacetylation represses trancription
.
Acetylation and deacetylation of the lysine residue.
Histone acetylation is catalyzed by histone acetyltransferases (HATs) and
histone deacetylation is catalyzed by histone deacetylases (denoted by HDs or
HDACs). Several different forms of HATs and HDs have been identified. Among
them, CBP/p300 is probably the most important, since it can interact with
numerous transcription regulators
Acetilasi e deacetilasi sono associate a co-regolatori
della espressione genica (attivatori e repressori, rispettivamente
(es.
- p300/CBP che interagisce con diversi fattori di trascrizione
Myo D e AP1 è una acetilasi che acetila N-terminus di H4:
questo enzima è bersaglio di proteine virali
- PCAF acetila H3, ecc
- Sin3, fa da proteina ponte tra SMART e HDAC per
inibire recettori intracellulari, quali RAR)
I PROCESSI DI METILAZIONE GIOCANO UN RUOLO
NELLA PATOGENESI UMANA