CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL
FARMACO
Adriana Maggi
BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE
2010-11
LEZIONE 14
FARMACI BIOTECNOLOGICI
PROTEINE TERAPEUTICHE
DI PRIMA E SECONDA GENERAZIONE
ACIDI NUCLEICI per la regolazione della
espressione di specifici geni
VANTAGGI NELL’UTILIZZO DI FARMACI
ANTI-ACIDI NUCLEICI
BERSAGLIO MOLECOLARE PIU’ DEFINITO
Numero di proteine intracellulari: 1000-100000
Numero di RNA: 100-10000
Numero di geni: 1-2
AZIONE MOLTO SPECIFICA
Bersagli possono essere sequenze anche uniche nel genoma
Utilizzando interazioni con altri nucleotidi si possono sfruttare i vantaggi
della complementarità tra due catene secondo il modello di Watson e Crick
…IL MEDICO ADOPRERA’ BENE
LE MEDICINE QUANDO LUI CONOSCERA’
CHE COSA E’ OMO,
CHE COSA E’ VITA E COMPLESSIONE,
CHE COSA E’ SANITA’…
ESPRESSIONE GENICA IN EUCARIOTE: SEQUENZA DI EVENTI
3’ TRASCRIZIONE
RNA, trascritto primario
Capping e poliadenilazione
MODIFICAZ.
TP
Splicing o maturazione
Fuoriuscita dal nucleo
riconoscimento da parte dei ribosomi
traduzione
TRADUZIONE
Modificazioni post-traduzionali
La rilevanza dei processi di regolazione
della espressione genica
nel disegno di nuovi farmaci
L’omeostasi cellulare è mantenuta da un
efficiente controllo della trascrizione genica
che viene assicurato da un complesso circuito
molecolare che utilizza fattori di trascrizione
individali, l’apparato basale di trascrizione e i
complessi multiproteici coregolatori della
trascrizione.
La cromatina ha un ruolo
fondamentale nella
reglazione della espressione
genica e la capacità degli
istoni di legare il DNA è
regolata da enzimi
intranucleari che possono
apportare modificazioni
post-traduzionali
soprattutto ai residui di
lisina e arginna posti nel
dominio N-terminale delle
proteine istoniche
Modificazioni degli istoni: acetilazione, fosforilazione,
metilazione, ubiquitinazione
MODIFICAZIONI POST-TRADUZIONALI DEGLI ISTONI
Zhang Y , Reinberg D Genes Dev. 2001;15:2343-2360
Metilazione degli istoni
La metilazione degli istoni aumenta lo stato di
idrofobicità e la basicità delle porzioni N
trminali degli istoni: questo ne aumenta
l’affinità per proteine specifiche e fattori di
trascrizione.
Le metilazsi necessitano di cofattori: es. la sadenosilmetionina
Generalmente la metilazione egli istoni si associa a repressione della
espressione genica, tuttavia ci sono esempi in cui la metilazione si associa
a attivazione della espressione genica (metilazione lella lisina 4 dell’istone
3, il coattivatore CARM1 è una metiltransferasi)
PROCESSI DI ACETILAZIONE E
DEACETILAZIONE SONO IMPORTANTI
NELLA REGOLAZIONE DELLA ATTIVITA’
DELLA CROMATINA
ESPRESSIONE GENICA E’ GENERALMENTE
ASSOCIATA CON
ACETILAZIONE
L’acetilazione dei residui di lisina al terminale NH degli istoni rimuove le cariche
positive riducendo quindi l’affinità degli istoni per il DNA: per questo l’acetilazione
degli istoni facilita i processi trascrizionali , al ontrario, la deacetilazione reprime la
trascrizione
.
Acetilazione e deacetilazione del residuo lisinico
ACETIL TRANSFERASI ISTONICHE :histone acetyltransferases (HATs)
DEACETILASI ISTONICHE: histone deacetylases (denoted by HDs or HDACs);
numerose deacetilasi sono associate a repressori della trascrizione;
Fosforilazione degli istoni
la funzione della fosforilazione degli istoni rimane
da essere pienamente compresa: è stato riportato
che la fosforilazione degli istoni puo’ facilitare
l’attacco di HATs
Enzimi quali le ERK possono fosforilare gli istoni
legando signaling di recettori di membrana allo
stato di fosforilazione degli istoni
Fattori di rimodellamento della cromatina
Due famiglie di fattori sono coinvolte nel rimodellamento
della cromatna: SWI/SFI e ISWI: in genere queste proteine
destabilizzano il legame tra istoni e DNA aiutando lo
“scivolamento” dei nucleosomi e la trascrizione del DNA :
queste proteine fungono quindi da enhancers della
trascrizione.
Esistono inoltre proteine non istoniche che facilitano il
legame delle HAT
Altri fattori di rimodellamento della cromatina agiscono
utilizzando ATP e possono riposizionare I nucleosomi sulla
cromatina (ACF e NAP-1)
Meccanismi di metilazione
del DNA e eredità epigenetica
Meccanismi di metilazione del DNA
e eredità epigenetica
Circa il 2-7% delle citosine nel DNA animale
subisce metilazione ad opera di specifici enzimi
che agiscono su sequenze palindromi:
5’ mCpG 3’
3’ GpCm 5’
CpG islands are genomic regions that contain a high frequency of CG
nucleotides. In mammalian genomes, CpG islands are typically 3003,000 base pairs in length. They are in and near approximately 40% of
promoters of mammalian genes (about 70% in human promoters).
The "p" in CpG notation refers to the phosphodiester bond between
the cytosine and the guanine.
The usual formal definition of a CpG island is a region with at least
200 bp and with a GC percentage that is greater than 50% and
with an observed/expected CpG ratio that is greater than 60%.
Another recent study revised the rules of CpG island prediction in
order to exclude other GC-rich genomic sequences such as Alu
repeats. Based on an extensive search on the complete sequences of
human chromosomes 21 and 22, DNA regions >500 bp with a GC
content >55% and observed CpG/expected CpG of 0.65 were more
likely to be the true CpG islands associated with the 5' regions of
genes.
ESPRESSIONE GENICA E’ GENERALMENTE
ASSOCIATA CON
DEMETILAZIONE
I GENI “HOUSEKEEPING” SONO ESPRESSI IN
MODO COSTITUTIVO E CONTENGONO
NEL LORO PROMOTORE MOLTE “ISOLE” CpG
NON METILATE
A Unifying Model for the Selective Regulation of
Inducible Transcription by CpG Islands and
Nucleosome Remodeling
Vladimir R. Ramirez-Carrozzi,1,2,5 Daniel Braas,1,2,5 Dev M. Bhatt,1,2,5 Christine S. Cheng,4
Christine Hong,1,2
Kevin R. Doty,1,2 Joshua C. Black,2,3 Alexander Hoffmann,4 Michael Carey,2,3 and Stephen T.
Smale1,2,*
Cell 138: 114, 2009
CpG island promoter: 70% dei promotori hanno
numerose sequenze ricche in CpG : basso livello di
metilazione delle CpG island che li rende indipendenti da
SWI/SNF remodeling complexes
Non CpG island promoter: 30% dei promotori che sono
altamente regolati trascriionalmente
Sindrome di Rett
MeCP2 gene
methyl DNA binding protein 2 (MeCP2)
The mechanism(s) by which the native MeCP2 protein operates in the
cell are not well understood.
Historically, MeCP2 has been characterized as a proximal gene
silencer with 2 functional domains:
1. a methyl DNA binding domain and
2. a transcription repression domain.
However, several lines of new data indicate that MeCP2 structure and
function relationships are more complex: an analysis of cell-based
experiments suggesting MeCP2 is a regulator, rather than a strict
silencer, of transcription. The new data establish MeCP2 as a
multifunctional nuclear protein, with potentially important roles in
chromatin architecture, regulation of RNA splicing, and active
transcription..
methyl DNA binding protein 2 (MeCP2)
MeCP2 binds preferentially to DNA methylated at CpG sites through an
85–amino acid methyl-CpG–binding domain (MBD) (amino acids 78–162)
Once bound to DNA, MeCP2 is thought to silence transcription of
downstream genes by recruiting corepressor complexes through a 104–
amino acid transcriptional repression domain (TRD) (amino acids 207–310)
One complex shown to associate with MeCP2 is the Sin3A corepressor
complex. This complex contains histone deacetylase (HDAC) 1 and HDAC2
and was originally shown to mediate repression by the DNA-binding
heterodimer, Mad-Max .
MeCP2 also interacts with two other corepressors, the proto-oncoprotein
of the Sloan-Kettering virus named after the Sloan-Kettering Institute (cSki) and the nuclear receptor corepressor (N-CoR). c-Ski and N-CoR are
components of histone deacetylase complexes that can but do not always
function together
It is interesting that repression by MeCP2 is not completely alleviated by
the histone-deacetylase inhibitor, trichostatin A (TSA), suggesting that
MeCP2 may also repress transcription in an HDAC-independent manner
Modeling Rett Syndrome with Stem Cells
Cell 143: 499, 2010
METILAZIONE DEL DNA E CANCRO
The alterations of DNA methylation level and
patterns are a common feature of human cancer
cells. A global DNA hypomethylation has been
observed in many cancers, without obvious
sequence specificity
Recently, an extensive study of about 1200 CpG islands has
indicated that hypermethylated CpG islands are not randomly
distributed and the patterns of the hypermethylation might
be specific of subclasses of cancers.
The methylation status of tumor suppressor genes has been
extensively investigated and such alterations have been
reported in many human tumors (Robertson and Jones,
2000).
METILAZIONE DEL DNA E CANCRO
Several reports link genome hypomethylation to
genome instability. In particular, it was shown
recently that strongly reduced DNMT activity in a
transgenic mouse model caused demethylation of
centromeric satellite and other repeat sequences,
which resulted in a variety of chromosome defects
and concomitant tumorigenesis
Peter Jones nel 1970 descrisse il differenziamento di cellule
embrioniche in cellule muscolari dopo esposizione a una
molecola capace di aumentare lo stato di metilazione del DNA
(5-Azacytidine) .
Nel 2004 la 5-azacytidine ( Vidaza) è stato approvato per il
trattamento della sindrome mielodisplastica
Nel 2006 è stato approvata un’altra molecola la decitabina
(Dacogen) : queste molecole sono substrati dell DNA
methyltransferasi.
Altri farmaci epigenetici in studio sono gli inibitori delle
acetiltransferasi (HDAC inhibitors) il primo di questi, SAHA
(zolinza) è stato approvato nel 2006 per il linfoma a cellule T
cutaneo.
O
N
H
N
N-hydroxy-N'-phenyl-octanediamide
O
H
OH
VORINOSTAT (Zolinza) è il primo inibitore delle acetilasi
istoniche approvato per il trattamento di neoplasie
Nel 2006 il VORINOSTAT è stato approvato per il
trattamento del linfoma a cellule T cutaneo
Esistono studi preclinici che indicano una attività
antinfiammatoria del vorinostat
Nel 2007 ricerche presso la Mayo Clinics hanno dimostrato
che il Vorinostat è efficace nel glioblastoma ricorrente
HDAC inhibitors can activate both the deathreceptor and intrinsic apoptotic pathways
REGOLAZIONE DELLA ESPRESSIONE GENICA IN EUCARIOTE
A LIVELLO TRASCRIZIONALE
TBP + 12 TAFs (TBP ass. factors)
TFIID recognizes TATA (Inr)
commitment
TFIIA; TFIIB; TFIIF
Pol II entry
TFIIE; TFIIH
Promoter clearence
TFIIF pol II binding
TFII H helicase and kinase
Bob Roeder
Lasker Award 2003
Promotori prossimali e promotori distali
ESPRESSIONE GENICA IN EUCARIOTE: SEQUENZA DI EVENTI
3’ TRASCRIZIONE
RNA, trascritto primario
Capping e poliadenilazione
MODIFICAZ.
TP
Splicing o maturazione
Fuoriuscita dal nucleo
riconoscimento da parte dei ribosomi
traduzione
TRADUZIONE
Modificazioni post-traduzionali
Biogenesi di RNA
messaggero e
regolazione genica
post-trascrizionale
Cell 136:777, 2009
INTRONI DI RNA NUCLEARE BERSAGLIO
DELL’APPARATO DI SPLICING
5’
Ruolo snRNP e proteine associate nello splicing 1
3’
5’
3’
5’
3’
Commitment complex (E complex)
U1 lega il sito di taglio in 5’ e U2AF lega
il sito polipirimidinico
Complex A U2 lega il sito “branch”
Complex B si associano U5, U6, U4
Ruolo snRNP e proteine associate nello splicing 2.
Riposizionamento, U1 si dissocia,
U5 si associa all’introne; U 6 lega
il sito di taglio in 5’
Complex C U4 si dissocia,
U6 e U2 catalizzano la
transesterificazione
U5 l’esone al sito di taglio in 3’
Avviene il taglio in 5’ e si forma il lariate
Avviene il taglio in 3’ e la ligazione
Tra gli esoni
LE SEQUENZE DI SPLICING SONO CONSERVATE NEI VERTEBRATI
5’ splice site: 5’-GU-3’
Tratto polipirimidinico
3’ splice site 5’-AG-3’
Esistono introni AU-AC sono simili a introni GU-AG ma richiedono
Un apparato di splicing differente
L’eliminazione di sequenze di RNA che non abbiano
subito il processamento è assicurata dalla presenza
di “nonsense-mediated mRNA decay” un
meccanismo di turnover di RNA che degrada
sequenze in cui sia presente un segnale di stop
Questo suggerisce la co-evoluzione dei meccanismi
di splicing e di traduzione del segnale
Mutazioni che alterano il codice di
slicing causano patologie specifiche
Cell 136: 777, 2009
Micro RNA e regolazione della espressione genica
ACIDI NUCLEICI IN TERAPIA
1.
ANTISENSO: desossinucleotidi complementari con l’m-RNA
2. ANTIGENE: desossinucleotidi complementari al DNA
3. RIBOZIMA: ribonucleotidi catalalitici complementari a RNA
4. APTAMERI: desossi e ribonucleotidi complementari a una sequenza
aminoacidica (competono con l’RNA nell’interazione tra RNA e
proteina)
5. DECOY: DNA complementare a sequenze aminoacidiche (competono
con sequenze di DNA nell’interazione DNA-proteina)
6. siRNA: RNA complementari a sequenze specifiche
Nuovi target farmacologici: GLI ACIDI NUCLEICI
FARMACI
TRADIZIONALI
DNA duplicato
DNA
RNA
PROTEINA
Duplicazione
Trascrizione
Maturazione
Metabolismo
Traduzione