Clonaggio: vettori plasmidici
I plasmidi sono molecole di DNA
extra-cromosomali che si auto-replicano
Sono presenti in natura in batteri, lieviti
e alcuni eucarioti superiori, in uno stato
di relazione parassitica o simbiontica
verso la cellula ospite
Molti plasmidi contengono caratteri (geni)
che arrecano beneficio alla cellula ospite (es.
resistenza a un antibiotico)
Molti plasmidi sono in grado di
auto-trasferirsi da una cellula all’altra.
• VETTORI PLASMIDICI
•
•
•
•
•
•
-> 0-10 kb
VETTORI l di inserzione
-> 0-10 kb
VETTORI l di sostituzione
-> 9-23 kb
VETTORI COSMIDICI
-> 30-44 kb
VETTORI PAC (crom. artif. P1) -> 130-150 kb
VETTORI BAC (crom. artif. batt.)-> fino a 300 kb
VETTORI YAC (crom. artif.lievito-> 0.2-2 Mb
Il batteriofago l
Le genoteche o librerie di DNA:
–Libreria genomica: collezione di cloni che
include tutto il DNA genomico di una certa specie
(es. il genoma umano aploide contiene circa 3x109
coppie di basi, che possono essere contenute in
circa 1.5x105 cloni di 20 kb ciascuno)
–Libreria di cDNA: collezione di cloni che
include tutte le specie di mRNA (trascritte in
cDNA) espresse in un dato tessuto, incluso quelle
piu’ rare
Costruzione di una libreria genomica
Costruzione di librerie genomiche utilizzando il fago
l come vettore
---GGATCC-----CCTAGG---
---GATC-----CTAG---
---G
GATCC-----CCTAG
G---
BamH1
+
BamH1
Sau3A
---G
GATCC-----CCTAG
G---
--GATC-----CTAG
---
--GATC-----CTAG
---
Sau3A
---GATC-----CTAG---
Sau3A
Costruzione di una libreria di cDNA
Analisi dei cloni ottenuti
• Crescita dei cloni, purificazione del
DNA plasmidico o fagico e analisi
con enzimi di restrizione
• Sequenziamento
• sottoclonaggio
Separazione di frammenti di DNA (o RNA) di
diversa lunghezza tramite elettroforesi
Visualizzazione dei frammenti separati per
elettroforesi
MAPPE DI RESTRIZIONE
Mappare multipli siti di restrizione
Separazione di frammenti di DNA (o RNA) di
diversa lunghezza tramite elettroforesi
IBRIDAZIONE DI ACIDI NUCLEICI
• La messa a contatto risultante nell’appaiamento di frammenti a singolo
filamento provenienti da due fonti diverse: una sonda (popolazione
omogenea di molecole note marcate) e un bersaglio (complessa ed
eterogenea popolazione di molecole di acido nucleico).
• Usata per determinare la presenza o la quantita’ di acidi nucleici con
una sequenza specifica corrispondente a quella della sonda nel
campione biologico analizzato.
• Le condizioni a cui si effettua la reazione di ibridazione determinano il
grado di divergenza delle sequenze analizzate (stringenza).
STRINGENZA
• La Tm (temperatura di fusione o melting T) caratterizza la stabilita’
dell’ibrido che si forma tra la sonda e il suo filamento complementare.
• La Tm e’ critica per determinare la temperatura ottimale per usare
sonde oligonucleotidiche come sonde per ibridizzare o come inneschi
per la reazione di PCR, o sonde non perfettamente complementari.
• La Tm dipende da:
–
–
–
–
–
Lunghezza della sonda
Composizione in basi (G+C e A+T)
Grado di omologia
Concentrazione della sonda e del bersaglio
Ambiente chimico:
• Concentrazione salina (i cationi monovalenti come ioni Na+ stabilizzano la
doppia elica, i denaturanti chimici come formamide o urea la destabilizzano)
Ibridazione su membrana
DNA a doppio filamento
fusione
DNA a singolo filamento
Il DNA si lega sul filtro
filtro
Incubare con sonda marcata
Lavare via il DNA
marcato non ibridizzato
autoradiografia
Sonde per ibridazione
• DNA
• RNA
Marcate sia
- tramite radioattivita’(nucleotidi trifosfati con un fosforo
radioattivo)
- tramite l’uso di guppi fluorofori (nucleotidi trifosfati
coniugati con guppo fluoroforo)
Marcatura enzimatica di una sonda a DNA (oligolabeling)
Marcatura di una sonda a RNA tramite sintesi in vitro
IBRIDAZIONE DI ACIDI NUCLEICI su membrana
• DNA->DNA
– Southern blot
– Ibridazione di colonie batteriche o placche fagiche - screening di librerie
• DNA->RNA (Northern blot)
• Southern e Northern blot individuano frammenti di DNA o RNA
bersaglio gia’ suddivisi in base alle dimensioni tramite elettroforesi su
gel
Trasferimento secondo Southern (Southern blot)
• Il Southern blot permette di effettuare mappaggi di
restrizione sia su DNA genomico totale che su DNA
ricombinante
• di individuare i cosiddetti polimorfismi di lunghezza dei
frammenti di restrizione (RFLP)
• di individuare le delezioni o inserzioni geniche
Mappatura della mutazione che determina l’anemia falciforme, che
distrugge un sito MstII e genera un RFLP specifico per la malattia
MstII: CCTNAGG
Colony o plaque lift e ibridazione