FIGURA 9.5
Screening di una genoteca tramite ibridazione con una sonda marcata. Per determinare quale clone in una genoteca
contenga il frammento di DNA d’interesse, si posiziona un disco di nitrocellulosa inumidito sulla piastra che contiene i cloni
cellulari e poi lo si rimuove. Questa procedura permette alle colonie originarie di rimanere nella loro posizione, ma di
trasferire una piccola porzione di cellule di ogni colonia sul disco. Con dei trattamenti specifici si causa la lisi delle cellule
che così liberano il loro DNA. Il DNA è quindi denaturato con NaOH e legato al filtro tramite esposizione al calore di un
forno e agli UV. In seguito, si applica la soluzione con la sonda marcata di DNA direttamente sul disco; la soluzione viene
lasciata abbastanza a lungo da permettere l’ibridazione tra la sonda e qualunque filamento complementare di DNA
presente in uno o più cloni. Il disco è poi recuperato e le sonde non ibridate sono lavate via. Se le sonde sono marcate con
isotopi radioattivi, si mette una pellicola per raggi X a contatto col disco per registrare la posizione degli spot che sono
radioattivi in seguito all’ibridazione con la sonda. Questo processo è chiamato autoradiografia. Confrontando le posizioni
degli spot sulla pellicola con la piastra batterica d’origine si identificano i cloni che contengono i frammenti di DNA che ci
interessano. (Da: Hartwell et al., 2004.)
Elementi di Biologia e Genetica
Vincenzo Nicola Talesa, Elvio Giovannini, Cinzia Antognelli
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