Manipolazione del DNA
in genetica umana e medica
Corso di Genetica Medica
Corsi di Laurea in Fisioterapia, Logopedia, Ortott.
Ass. Oft, T.N.P.E.
Facoltà di Medicina e Chirurgia
Alberto Piazza
Biotecnologie per la diagnosi
genetica molecolare
Analisi a bassa risoluzione
– Analisi cromosomica (del cariotipo)
– RFLP (restriction fragment length polymorphisms)
– Southern blotting - DNA
– Northern blotting - RNA
– Western blotting - proteine
– PCR (polymerase chain reaction) – amplificazione del DNA
Analisi ad alta risoluzione
– RFLP
– DNA Sequencing - determinazione dei nucleotidi
– PCR – amplificazione del DNA
Sonde (probes) molecolari
Reagenti usati per identificare una sequenza specifica di DNA o
RNA in un miscuglio complesso in cui è avvenuta una ibridazione
(accoppiamento di basi complementari tra il filamento singolo
della sonda ed il filamento singolo bersaglio di DNA o RNA). Le
sonde sono comunemente marcate da materiale radioattivo o
fluorescente.
Sonde cDNA- sequenze di DNA complementare a RNA
(originariamente prodotte mediante trascrizione inversa di RNA),
in grado di identificare sequenze di esoni (espressi)
Sonde oligonucleotidiche- sequenze di DNA prodotte
sinteticamente lunghe 14- 25 nucletidi
Sonde RNA- RNA marcato in grado di identificare sequenze di di
DNA o RNA complementari
Analisi cariotipica spettrale
Ibridazione In Situ
Fluorescente (FISH)
24 sonde DNA
cromosomaspecifiche, ciascuna
marcata con una
combinazione
differente di 5
fluorocromi
IBRIDAZIONE IN
SITU CON:
A) SONDE CHE
VISUALIZZANO
SINGOLI
CROMOSOMI
B) SONDE CHE
VISUALIZZANO
TUTTI I
CROMOSOMI
A
C) SONDE CHE
VISUALIZZANO
SPECIFICHE BANDE
“CHROMOSOME
BARR CODE”
C
B
“Fishing for genes”
Endonucleasi di restrizione
Enzimi che tagliano il DNA a doppia elica in siti specifici
Blunt Ends = estremità prive di estensione
Endonucleasi di restrizione
EcoRI non taglierà questa sequenza
Southern Blotting (DNA)
Diagnosi della sindrome da
androgeno resistenza per mezzo
dell’analisi del Southern blot
Il DNA dal gel di agarosio è stato
trasferito su nitrocellulosa ed
ibridizzato alla sonda cDNA di un
recettore androgenetico. Si osservano
3 frammenti genomici nel DNA di
entrambi i genitori ma non in quello
del figlio.
Conclusione: Il gene per il recettore
androgenetico (AR) è X-linked. La
madre ha solo un gene AR intatto
(l’intensità delle bande è simile a
quella della padre). Il figlio ha ereditato
dalla madre il cromosoma X che ha
una delezione nel gene AR.
Mutazioni puntiformi
Due mutazioni puntiformi che cambiano la sequenza nucleotidica
EcoRI non è in grado di tagliare le due sequenze mutate
Polimorfismi del DNA
polimorfismi del DNA = differenze nella sequenza di DNA
–per definizione due o più alleli ad un locus la cui
frequenza nella popolazione è >1%
Il termine polimorfismo viene esteso ai casi di cambiamento
nella sequenza del DNA: negli RFLP per indicare differenze
nelle lunghezze dei frammenti di restrizione causate da perdita o
guadagno di siti di restrizione nel DNA, nelle delezioni o
inserzioni di DNA, nelle ripetizioni di gruppi nucleotidici nei
microsatelliti e minisatelliti, nelle ripetizioni di trinucleotidi, nelle
mutazioni puntiformi (SNP), etc.
Polimorfismi RFLP e Southern Blot
Si possono identificare solamente i frammenti di DNA che ibridizzano con
la sonda molecolare (probe)
Diagnosi molecolare
dell’anemia falciforme
la sonda non ibridizza con il frammento MstII di 0.2 Kb
Analisi di un albero famigliare
mediante RFLP e Southern Blot
in questa famiglia l’allele 2 è concatenato alla malattia
Polimorfismi VNTR e STR
I minisatelliti (VNTR, Variable Number of Tandem Repeats) sono lunghi
più di 12 basi
I microsatelliti (STR, Short Tandem Repeats) sono lunghi da 2 a 4 basi
Gli alleli A and B al
locus X differiscono per
il numero di ripetizioni
di minisequenze
(tandem repeats)
La sonda (probe) 1 – una sonda single-locus - identifica un
tratto di DNA esclusivo di un locus
La sonda (probe) 2 –una sonda multiple-locus – identifica
tratti di DNA che si ripetono in più loci
Una famiglia tipizzata per un
polimorfismo VNTR
“DNA Fingerprinting”
per il test di paternità
Chi tra F1 e F2 è il padre biologico di C?
Sonde a molti loci con
molti alleli
Dal 5 al 10% dei figli hanno un padre
biologico diverso dal padre presunto
Il “Northern blot” è una tecnica usata per determinare in quale
tessuto o tipo cellulare è espresso un gene, ed anche la
lunghezza e la quantità di mRNA. I livelli di mRNA sono spesso
correlati ai livelli di proteina presente nel tessuto.
AMPLIFICAZIONE IN
VITRO DEL DNA
“REAZIONE A CATENA
DELLA POLIMERASI
(PCR)”
PCR: Reazione a catena della polimerasi
Metodo di amplificazione del DNA usando una polimerasi
termostabile quale la Taq DNA polimerasi, uno stampo di DNA, un
eccesso di primers e dideossinucleotidi (dNTP) in un buffer.
PCR: Reazione a catena della polimerasi
PCR: Reazione a catena della polimerasi
PCR: amplificazione
n.ro cicli
n.ro sequenze bersaglio
1
0
3
2
10
256
15
8192
20
262.144
25
8.388.608
30
268.435.456
La sequenza bersaglio è la
sequenza di DNA sintetizzata
tra i due primers
Occorre ~1g di DNA per l’analisi di una sequenza o una digestione con enzimi di restrizione tali da poter
essere visibili in elettroforesi. Se vi sono ~5 pg di DNA/cellula umana (5x10-12g) allora ~1 g of DNA
potrebbe essere isolato da 200.000 cellule ma avremmo un miscuglio di tutti i geni.
In 1  g di DNA genomico, una copia singola di un gene (300 bp) equivarrebbe a ~0.1 pg di DNA.
Questo 0.1 pg di DNA potrebbe essere amplificato mediante PCR producendo 0.8  g in 25 cicli e 27  g in
30 cicli.
PCR/RFLP per l’analisi dell’anemia falciforme
PCR/VNTR/STR in genetica forense
Quale delle persone sospette può avere
commesso il crimine?
La tecnica PCR è utile, spesso
necessaria, per amplificare il DNA
estratto dai reperti trovati sulla scena del
delitto. Si usano sonde multi-locus con
molti alleli.
IL MODELLO DI WATSON E CRICK
LA DOPPIA ELICA VISUALIZZATA CON IL
MICROSCOPIO A SCANSIONE A FORZA ATOMICA
IMMAGINE AL MICROSCOPIO A FORZA ATOMICA DEL GENE CHE
CODIFICA PER LA CONNESSINA UMANA
SEQUENZA DEL GENE DELLA BETA GLOBINA UMANA
Sequenziamento del DNA (1):
strutture dei nucleotidi
Sequenziamento del DNA (2):
il metodo di Sanger
Il contenuto di ciascuna provetta viene caricato in 4 pozzetti separati di un gel di poliacrilammide
*
Indica il primer (lungo 15 nucleotidi)
** I dNTP sono ad una concentrazione 100 volte superiore di quella dei ddNTP in ciascuna provetta
Sequenziamento del DNA (3):
il metodo di Sanger
pozzetti
autoradiogramma
Si legga la sequenza man mano sintetizzata dal basso verso l’ alto. Il nucleotide G è il più
vicino al primer (* indica il primer (lungo 15 nucleotidi)) e l’estremità 5’ mentre il nucleotide T
è all’estremità 3’. 5’GCTCCACGTAACGT3’ Questa sequenza è complementare al filamento
stampo.
ORGANISMI DI CUI IL GENOMA È
COMPLETAMENTE SEQUENZIATO
(AGOSTO 2003)
Virus
Batteri
Eucarioti
>1000
>100
19
EUCARIOTI
Vertebrati
Invertebrati
Piante
Funghi
Protozoi
4
3
8
3
1
Il Progetto Genoma Umano
Obiettivi
1. Costruire una mappa di marcatori genetici (polimorfismi)
polimorfismo – due o più alleli che si manifestano in una
popolazione con una frequenza maggiore dell’1%
- fino ad oggi sono stati identificati circa 2.165.000 SNP (Single
Nucleotide Polymorphisms) e 133.000 STS (Sequence Tagged
Sites, coppie di primers PCR), polimorfismi distribuiti nel genoma
umano
- tali marcatori dovrebbero idealmente essere sufficientemente
vicini così che di ogni malattia ereditaria possa essere identificato
il gene o i geni responsabili
2. Stabilire una mappa “fisica” della localizzazione dei geni in
relazione ad altri geni sui cromosomi
3. Sequenziare l’intero genoma umano aploide di 3 x 109 bp
Esempio di mappa fisica
e genetica nel Genoma
Umano
Lungo tutto il genoma sono stati
identificati (2002) circa
2.165.000 SNP e 133.000 STS
Single Nucleotide
Polymorphisms (SNP)
Sequence Tagged Sites (STS)
(coppie di primers PCR)
Restriction Enzyme Sites (NotI)
1 centiMorgan (cM) = 2*106bp
STS
Notl STS
cM
Il gene umano medio
Uno degli scopi del progetto Genoma Umano è di sequenziare le 3 x109 basi
nucleotidiche del genoma il cui numero di geni è stimato intorno a 40.000.
Il gene umano medio
Lunghezza
17.000 coppie di basi (17 kb)
Numero di esoni
7
Lunghezza dell’esone
100-200 nucleotidi
Lunghezza dell’introne
200-2.000 nucleotidi
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Manipolazione del DNA in genetica umana e medica