MARCATURA ISOTOPICA
Radioisotopi più usati per marcare gli acidi nucleici
Isotopo
3H
32P
33P
35S
Emivita
12.4 anni
14.3 giorni
25.5 giorni
87.4 giorni
Tipo di emissione
beta beta beta beta -
Energia di emissione
0.019 MeV
1.710 MeV
0.248 MeV
0.167 MeV
Marcatura con 3H :nucleotide con isotopo in posizioni diverse
Marcatura con 32P, 33P:
1) nucleotidi con l’isotopo nel gruppo fosfato in  (marcatura interna);
2) un nucleotide con l’isotopo nel gruppo fosfato in  che viene sostituito dal P
del nucleotide terminale (marcatura terminale con chinasi)
Marcatura con 35S: inserito nucleotide con l’isotopo
fosfato in posizione 
35S
al posto dell’O- del gruppo
MARCATURA INTERNA DEL DNA MEDIANTE “RANDOM
PRIMING”
Klenow:
attività endonucleasica 5’
no esonucleasica 5’ 3’
(distruggerebbe primer)
si esonucleasica 3’ 5’
3’
MARCATURA INTERNA DEL DNA MEDIANTE “RANDOM
PRIMING”
MARCATURA TERMINALE DEL DNA MEDIANTE
POLINUCLEOTIDE CHINASI
MARCATURA NON ISOTOPICA
- Diretta: incorporazione di nucleotidi modificati contenenti un fluoroforo
(gruppo chimico che emette fluorescenza se esposto a certe lunghezze
d’onda)
- Indiretta: incorporazione di un nucleotide al quale è stato legato un
gruppo indicatore (R); individuazione dell’ibridazione della sonda per
riconoscimento di (R) da parte di un “anticorpo” (A) che viene evidenziato
con un marcatore (M)
Digossigenina (steroide vegetale) e biotina (vitamina B7) hanno un gruppo
indicatore (incorporato nell’acido nucleico) che può essere riconosciuto
da ligandi specifici.
Esempi:
La biotina viene legata dall’avidina (glicoproteina presente nell’albume
dell’uovo) legata a marcatore fluorescente
saggio fluorimetrico;
La digossigenina viene legata da un anticorpo monoclonale coniugato con
la fosfatasi alcalina
saggio enzimatico con conversione di un
substrato incolore
Fluorofori per la marcatura non isotopica diretta
dUTP
Fluorescin-dUTP
(verde)
Rhodamine-dUTP
(rosso)
Marcatura non isotopica indiretta
Marcatura non
isotopica
indiretta
Deossiuridina trifosfato
(dUTP) modificata con Biotina,
ibridazione con Avidina
accoppiata con
marcatore fluorescente
Sonda DNA complessata
con perossidasi di rafano
(Horseradish peroxidase,
HP) + luminolo: sviluppo
di chemioluminescenza
rilevata con
autoradiogramma
Tipi di sonda utilizzati per l’ibridazione degli acidi
nucleici: DNA, RNA, Oligonucleotidi
Tipi di ibridazione:
Southern blot (in genere: marcatura isotopica)
Northern blot (in genere: marcatura isotopica)
Ibridazione di filtri con colonie (in genere: marcatura isotopica)
Ibridazione in situ di cromosomi per mappatura citogenetica (ora non
isotopica)
Ibridazione in situ di tessuti (ora non isotopica)
Ibridazione di filtri con spot di DNA da PCR (dot blot)
IBRIDAZIONE DI UN SOUTHERN BLOT
Specificità dell’ibridazione:
Temperatura di ibridazione
Concentrazione salina
Temperatura lavaggi
IBRIDAZIONE DI UN NORTHERN BLOT
IBRIDAZIONE DI FILTRI CON COLONIE
IBRIDAZIONE IN SITU su campione intero
Espressione di un gene per la crescita dei fibroblasti nell’embrione di pollo.
Trascritti marcati con sonda antisenso marcata con digossigenina e rilevati
con anticorpi antidigossigenina accoppiati a fosfatasi alcalina
MAPPATURA CITOGENETICA CON IBRIDAZIONE IN SITU
DI SONDE MARCATE
Procedura sperimentale:
- Mitosi fissate su vetrino
- Parziale deproteinizzazione con proteasi
- Denaturazione ad alte temperature (90-100°C)
- Ibridazione con sonda denaturata e marcata con isotopo radioattivo o
colorante fluorescente
- Lavaggi
- Esposizione con lastra autoradiografica e sviluppo
Svantaggi dell’uso di tritio:
- Utilizzo del radioattivo
- Bassa risoluzione (diffusione della radiazione ed alto background)
- Bassa sensibilità
MAPPATURA CITOGENETICA CON IBRIDAZIONE IN SITU
MAPPATURA CITOGENETICA CON IBRIDAZIONE IN SITU
- Localizzazione diretta di sonde su cromosomi metafasici
- Posizionamento contemporaneo di più sonde lungo i cromosomi
- Localizzazione di sonde rispetto a bande e strutture conservate
(centromeri e telomeri)
Fluorescent In Situ Hybridization: FISH
Ibridazione in situ fluorescente
- Metodo diretto:
Marcatura della sonda con nucleotidi coniugati a fluorocromi
- Metodo indiretto:
Riconoscimento della sonda con una seconda sonda marcata con fluorocromi
Visualizzazione diretta al microscopio a fluorescenza
- FISH SU CROMOSOMI METAFASICI (Risoluzione 1 Mb)
- FISH SU CROMOSOMI INTERFASICI (Risoluzione tra 500-50 Kb)
- FISH SU CROMOSOMI IN INTERFASE ARTIFICIALE (700 - 5 Kb)
(Fiber FISH)
MICROSCOPIA A FLUORESCENZA
dUTP
Fluorescin-dUTP
(verde)
Rhodamine-dUTP
(rosso)
FISH
Ibridazione con sonda che copre il sito di rottura cromosomica
FISH multicolore
- Utilizzo sostanza fluorescenti con diverso spettro di emissione (FITC,
fluorescina isotiocianato, Texas Red, rodamina)
- Utilizzo contemporaneo di sonde marcate con diversa localizzazione
lungo il cromosoma
CHROMOSOME PAINTING
- Sonde: collezione di frammenti specifici di ogni cromosoma
- Ogni cromosoma risulta fluorescente ed ha un colore diverso
- Utilizzo di un microscopio a fluorescenza ed analisi digitale
dell’immagine
- Cariotipo molecolare (spectral karyotype SKY)
CHROMOSOME PAINTING
Sonde: collezione di frammenti specifici di un singolo cromosoma
Cromosomi fluorescenti con colori diversi
Utilizzo di un microscopio a fluorescenza ed analisi digitale dell’immagine
Chromosome
painting
FISH
multicolore