COME PRODURRE UN FIORE
STUDIARE I GENI COINVOLTI NELLO SVILUPPO FIORALE
Dott.ssa Gregis Veronica Ibridazione in situ
Dov’è espresso il gene d’interesse?
In che tessuti e strutture è presente il suo mRNA?
• Questa metodica si basa sull’ibridazione di sonde marcate direttamente su cellule o tessuti. Si può ibridare su sezioni istologiche o su materiale non sezionato (in quest’ultimo caso si parla whole‐mount).
• E’ una delle poche tecniche che permette di localizzare l’espressione di un dato mRNA a livello delle singole cellule.
• Ideale per studiare i geni espressi in un gruppo ristretto di cellule all’interno di un tessuto, o i geni la cui espressione è modulata nel tempo e nello spazio (estremamente utilizzata negli studi di biologia dello sviluppo).
Ibridazione in situ
IBRIDAZIONE DI ACIDI NUCLEICI
• Ibridazione: appaiamento di 2 molecole di DNA o RNA complementari
Ibridazione in situ
Fissaggio del tessuto e imbibizione in paraffina
Scelta del tessuto da analizzare
Taglio del tessuto al microtomo
Ibridazione con sonda a RNA antisenso
Fette di 8 μm da montare su vetrini polilisinati
Metodi di marcatura degli acidi nucleici
Le DNA polimerasi batteriche possono essere
purificate e utilizzate per sintetizzare DNA in vitro
Metodi di marcatura degli acidi nucleici
Metodi di marcatura degli acidi nucleici
Metodi di marcatura degli acidi nucleici
RNA Metodi di marcatura degli acidi nucleici
MARCATURA CON DIGOSSIGENINA
Si basa sull’incorporazione nella catena di DNA, in fase di sintesi,
di deossiuridina trifosfato il quale, mediante un braccio
spaziatore, porta legata la digossigenina (Dig‐dUTP).
MARCATURA CON FLUORESCINA
La fluorescina è legata all’uridina mediante un braccio spaziatore.
digossigenina
fluoresceina
Metodi di marcatura degli acidi nucleici
Metodi di marcatura degli acidi nucleici
La sonda così ottenuta viene utilizzata per l’
ibridizzazione su vetrino e viene rivelata
immunologicamente utilizzando un anticorpo
monoclonale anti‐digossigenina o anti‐fluorescina
coniugato con la fosfatasi alcalina. Si forma così
un complesso evidenziato aggiungendo un adatto
substrato della fosfatasi alcalina (X fosfato) e il
colorante nitroblutetrazolio (NBT) oppure Fast
Red chromogen.
Ibridazione in situ
Sonda antisenso
specifica per il gene SVP
marcata con Dig-dUTP
Ibridazione in situ
doppia marcatura
Sonda antisenso
specifica per il gene
TFL1 marcata con DigdUTP
Sonda antisenso
specifica per il gene LFY
marcata con FluorescindUTP
Utilizzo dei fluorofori per la localizzazione di proteine in vivo mRNA di SVP presente nei primordi del fiori
MA LA PROTEINA DOVE SI TROVA???
Posso creare una proteina di fusione con la GFP!
Utilizzo dei fluorofori per la localizzazione di proteine in vivo Perché la GFP?
•l'assorbimento ha dei picchi con radiazioni a lunghezze d'onda di 395 nm
(ultravioletto) e 475 nm (spettro visibile blu) mentre l'emissione avrà un picco
massimo intorno a 505 nm (colore verde).
•la fluorescenza della GFP è un fenomeno intrinseco alla stessa proteina e non
richiede substrati né enzimi
•legata covalentemente ad altre proteine, non interferisce con la normale
attività della molecola a cui è legata.
•Esistono diverse varianti con diverse caratteristiche di assorbimento ed
emissione :
•YFP (yellow fluorescent protein) giallo
•CFP (cyan fluorescent protein) azzurro‐grigio
•BFP (blue fluorescent protein) blu.
Utilizzo dei fluorofori per la localizzazione di proteine in vivo ATG
pSVP
TGA
SVP genomic region
GFP
bp 6300
Plasmide contenente la proteina di fusione
E. coli
Agrobacterium
Arabidopsis
Controllo la presenza del costrutto in pianta e l’espressione della proteina di fusione
Utilizzo dei fluorofori per la localizzazione di proteine in vivo mRNA di SVP
Il trascritto è presente nei primordi dei fiori prima della differenziazione degli organi fiorali
Proteina di fusione pSVP:SVP‐GFP
La proteina si localizza nei nuclei delle cellule dei primordi
The Arabidopsis floral meristem identity genes AP1, AGL24 and SVP directly repress class B and C floral homeotic genes
V. Gregis, A. Sessa, C. Dorca‐Fornell and M. Kater. The Plant Journal 2009
Utilizzo dei fluorofori per la localizzazione di proteine in vivo Confocal microscopic analysis of SEP3:GFP localisation in inflorescence meristem and early flower bud stages.
(A) Overview of an inflorescence with the inflorescence meristem and early flower bud stages 1 to 5 indicated. SEP3:GFP protein is detected as green signal and cell membranes are stained with the red dye FM4‐64. (B) Detail of an inflorescence meristem and a stage 2 flower bud. (C) Section through tissue in (B) showing the SEP3:GFP signal in the epidermis and the beginning SEP3:GFP signal in the centre of the stage 2 flower bud. (D) Detail of a stage 4 flower bud showing the highest SEP3:GFP signal in the entire floral meristem and only in the epidermis of the four sepals. (E) Section through the stage 4 flower bud in (D) showing both cytoplasmic and nuclear localisation of SEP3:GFP in the future second and third whorl, and only nuclear localisation in the innermost part of the floral meristem. (F) More basal section through the stage 4 flower bud in (D) showing again both cytoplasmic and nuclear localisation of SEP3:GFP in the future second and third whorl. In planta localisation patterns of MADS domain proteins during floral development in Arabidopsis thaliana
S. Urbanus, S. de Folter, A.Shchennikova, K. Kaufmann, R.Immink and G.Angenent. BMC Plant Biology 2009,
Molecole e cellule a colori
CusMiBio, Milano 22-24 Settembre 2010
Dott.ssa Colombo Monica
Il microscopio ottico: sfrutta la luce con lunghezza
d'onda dal vicino infrarosso all'ultravioletto, coprendo
tutto lo spettro visibile.
Campione da osservare: deve permettere il passaggio
della luce che lo illumina da sotto.
Stereomicroscopio ottico
Utilizza due percorsi ottici separati diversamente
allineati con due obiettivi e due oculari per provvedere
immagini leggermente diversamente angolate agli
occhi destro e sinistro. In questo modo produce una
visione stereoscopica del campione in esame.
Il campione può essere osservato tal quale, senza
necessità di un trattamento particolare.
Gli ingrandimenti ottenibili vanno da poche unità a
circa 200 X.
Il Microscopio Elettronico a Scansione
(SEM)
Sfrutta la generazione di un
fascio elettronico ad alta energia
nel vuoto.
•
•
•
•
•
Alti ingrandimenti (fino a 100000x)
Alta risoluzione (limite 2nm)
Tridimensionalità
Versatilità: sia per quanto riguarda la natura (solo materiali contenenti fluidi non
sono analizzabili) che forma e dimensioni (di qualunque forma, fino a circa un
decimetro cubo)
Facile preparazione del campione: qualora non siano naturalmente conduttivi
(metalli), devono solo essere ricoperti da un sottilissimo strato di un elemento
conduttore (grafite o oro).
• Generatore di elettroni, dove viene creato
il fascio di elettroni
• il fascio viene focalizzato da un sistema di
lenti e deflesso per scandire una area del
campione
• nella camera da vuoto il fascio elettronico
interagisce con il campione (scansione)
• L’interazione fascio-campione genera vari
segnali che vengono acquisiti da vari tipi di
rivelatori e trasferiti agli elaboratori
• Sullo schermo si ricostruisce l’immagine a
livelli di grigio
E’ molto importante, quando si studia lo sviluppo, conoscere il profilo di
espressione dei geni sotto indagine. E’ cioè necessario conoscere in
quale stadio dello sviluppo essi sono attivi, in quale parte e a che livello
di attività essi sono espressi.
I metodi in situ sono quelli sviluppati per rivelare in un campione i
domini spaziali dove avviene l’espressione dei geni.
L’ibridizzazione in situ rivela le regioni del campione dove uno
specifico mRNA è presente.
Con la tecnica dei reporter genes è possibile vedere se in un campione
una data sequenza regolativa (promotore) è attiva.
Saggio GUS (saggio istochimico di attività β-glucuronidasica): è una tecnica di
biologia molecolare utile per l'analisi dell'attività di un promotore.
La tecnica è basata sull'enzima di Escherichia coli β-glucuronidasi (uidA); questo
enzima idrolizza specifici substrati incolori e non fluorescenti (non endogeni),
convertendoli in sostanze colorate, dunque visibili all'operatore.
La sequenza regolativa da testare è fusa al gene (β-glucoronidasi). Se la
sequenza regolativa è attiva in quello specifico tessuto o stadio, il gene è
espresso.
Esistono diversi glucuronidi che possono essere usati come substrato della
reazione enzimatica. Per la colorazione istochimica viene utilizzato
prevalentemente il 5-bromo-4-cloro-3-indolil glucuronide (X-Gluc) che, idrolizzato,
produce una molecola blu insolubile che viene facilmente visualizzata nel posto
dove si forma e con alta sensibilità.
Un organismo è adatto per il saggio GUS se non ha una propria attività βglucuronidasica o la propria attività risulta talmente bassa da rappresentare un
disturbo accettabile. Per questa ragione il saggio non può essere utilizzato in
quasi tutti i vertebrati e in molti molluschi. Nelle piante superiori, nei muschi, nelle
alghe, nei funghi e in quasi tutti i batteri non c'è attività GUS endogena.
GUS expression analysis
Tissues were prefixed in 90%
acetone at − 20 °C for 1 h and
washed three times for 5 min
with 50 mM phosphate buffer
(pH 7.0) before incubation at
37 °C overnight in reaction
buffer (1 mg ml−1 X-Gluc,
0.1% Triton X-100, 2 mM
Fe2+CN , 2 mM Fe3+CN , 50
mM phosphate buffer pH 7.0,
10 mM EDTA).
Tissues were cleared in 70%
ethanol, then mounted in
glycerol 20% and observed.
(A-E): SHP2::GUS
(F-L): STY1::GUS
(M–S) NGA3:GUS
Altri sistemi reporter
Altri sistemi in competizione con il GUS sono basati
su, per esempio, luciferasi, GFP, β-galattosidasi,
cloramfenicolo acetiltransferasi e fosfatasi alcalina.
GFP: Il gene è fuso a quello di proteine di interesse
in modo che, quando la fluorescenza è visibile nel
campione, significa che la proteina a cui la GFP è
legata è espressa.
La luminescenza di GFP è un fenomeno intrinseco
alla stessa proteina e non richiede substrati né
enzimi.