pGLO™ Transformation and Purification of
Green Fluorescent Protein (GFP)
OBIETTIVO GENERALE DELL’ESPERIMENTO
Espressione eterologa di una proteina eucariotica in procarioti
FASI SPERIMENTALI
(A) Transformazione di batteri con il plasmide pGLO
(B) Purificazione della GFP su colonna idrofobica
(A)
(B)
LA GFP (green fluorescent protein) è una proteina
fluorescente che puo’ essere espressa in eucarioti e procarioti
sotto il controllo di specifici promotori.
I promotori possono essere inducibili (procarioti)
o cellula/ tessuto- specifici (eucarioti)
GFP si puo’ anche usare per produrre
proteine di fusione
http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/prasher.html
With permission from Marc Zimmer
• LA TRASFORMAZIONE INTRODUCE DNA ESTRANEO IN UNA
CELLULA BATTERICA
IL DNA PUO’ ESSERE INTRODOTTO CON:
- SHOCK ELETTRICO (ELETTROPORAZIONE)
- AGENTE CHIMICO (CaCl2)
*
GFP
Beta-lactamase
Ampicillin
Resistance
IN QUESTO CASO IL DNA INTRODOTTO E’ IL PLASMIDE pGLO
Il plasmide pGLO
• Bla= beta-lattamasi
(resistenza ampicillina)
• AraC= proteina
regolatrice dell’operone
arabinosio
• GFP sotto controllo del
promotore pBAD
inducibile in presenza
di arabinosio
pBAD
OPERONE ARABINOSIO E
PLASMIDE DI ESPRESSIONE
ara GFP Operon
ara Operon
araC
B
A D
araC
Effector (Arabinose)
Effector (Arabinose)
araC
B A D
araC
RNA Polymerase
araC
B
A D
GFP Gene
GFP Gene
RNA Polymerase
araC
GFP Gene
PROCEDURA DI
TRASFORMAZIONE
• Risospendere le colonie batteriche nella
soluzione contenente cloruro di calcio
• Aggiungere DNA plasmidico pGLO
• Mettere in ghiaccio
• Heat-shock a 42°C e mettere in ghiaccio
• Incubare con terreno di crescita (LB)
• Piastrare
• Le colonie batteriche che hanno
incorporato il plasmide crescono su tutte e
tre le piastre
• Solo in presenza di arabinosio si osserva
fluorescenza (= si esprime la GFP)
Day 1
Day 2
•CRESCITA COLTURA BATTERICA
•ROTTURA DELLE CELLULE
•SEPARAZIONE FRAZIONE SOLUBILE
•ISOLAMENTO DELLA PROTEINA
RICOMBINANTE GFP
Hydrophobic
bead
+ + ++
-
-
O
-O S O- + - H
+N H
O
HH
O O+
O O
Hydrophobic
bead
S
1. Lisato batterico in alto sale su colonna
+ +
2. Lavaggio tampone in basso sale
3. Eluizione in tampone senza sale
GFP Purification
Procedures
Overview
Day 1
Day 2
Day 3