CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO
Docente: Adriana Maggi
AA 2011/2012
Lezione 10
Valeria Benedusi
Biological reporter:
molecules acting as
surrogate, measurable,
indicators of a given
molecular event
Geni reporter
I sistemi reporter sono utilizzati per lo studio di
regioni promotore o enhancer e della loro interazione
con elementi trans-regolatori
L’attività di un promotore e il ruolo funzionale degli
elementi di controllo ivi presenti è valutata clonando
questa regione a monte del gene reporter, contenuto
solitamente in un plasmide di espressione.
I plasmidi ricombinanti vengono poi introdotti in
opportune linee cellulari in cui si va poi a quantificare
la concentrazione della proteina reporter prodotta o
della sua attività enzimatica
Geni reporter
I geni reporter codificano per una specifica attività enzimatica che
risponde a diverse caratteristiche:
•deve essere assente nella specie in esame e facilmente distinguibile
da ogni attività enzimatica simile presente nella cellula;
•non deve presentare competizione o interferenza con altre attività
enzimatiche cellulari;
•il saggio deve essere semplice, rapido, sensibile e riproducibile.
In saggi in cellule eucariotiche i geni reporter più usati sono quelli
codificanti per enzimi batterici:
CAT ( cloramfenicolo acetil transferasi)
β-galattosidasi
GUS (β-glucuronidasi)
LUC (Luciferasi)
GFP (green fluorescent protein)
Lo studio della regolazione dell’espressione
genica. I sistemi reporter
X
Elementi di
regolazione
trans
Y
Promotore
Proteina
facilmente
dosabile
Z
Gene reporter
Elementi di regolazione cis
Con i sistemi reporter è possibile studiare sia gli elementi cis
che trans di regolazione della trascrizione.
Inoltre è possibile effettuare lo screening di molecole in
grado di interferire con l’espressione del gene reporter.
Questo principio può essere esteso agli animali transgenici
Saggio reporter
ER ER
ERE
(Estrogen Responsive Element)
Screening di molecole farmacologicamente
attive.
ER cDNA
LUC
Potenziali
ligandi
ER ER
LUC
LUC Units
ERE
CTR
E2
CTR
I geni reporter
GENE
VANTAGGI
B-Galattosidasi Ben caratterizzata, stabile,
(Batterica)
rilevazione automatizzabile
Luciferasi
(Lucciola)
Fosfatasi
alcalina
(Umana)
Alta attività specifica,
mancanza di attività
endogena (basso
background)
Proteina di secrezione,
saggio colorimetrico molto
sensibile.
fluorescent
proteins (GFP,
varianti RFP,
BFP)
Monomerico, non richiede
substrato, assente nei
mammiferi, varianti con
diversa l di fluorescenza.
SVANTAGGI
Presenza di attività endogena
in cellule di mammifero,
enzima tetramerico (risposta
non lineare)
Richiede l’aggiunta di
cofattore, O2, ATP.
Elevata attività endogena in
alcuni tipi cellulari.
Bassa sensibilità per
mancanza di amplificazione
(non è una reazione
enzimatica)
Fluorescent proteins
La Green Fluorescent Protein (GFP) è una proteina naturale
(prodotta dalla medusa Aequorea victoria) di piccole dimensioni (238
aa 26,9 kd) che se eccitata da una radiazione nel campo
dell’ultravioletto (l 395 nm), ma anche del visibile (l 475 nm, colore
blu) emette una radiazione di colore verde (505 nm)
Osamu Shimomura
Premio Nobel 2008
Il fluoroforo di GFP è un
tripepide Ser-deidroTyr-Gly
che è ciclizzato:
p-idrossibenzilideneimidazolidone
Nella struttura tridimensionale della GFP alcuni residui basici fanno
ponti a idrogeno con atomi di ossigeno (His148 con Tyr66 e Gln94 o
Arg96 con l’ imidazolidone.) stabilizzando il fluoroforo
L’emissione di luce avviene tramite un meccanismo sequenziale di un
processo autocatalitico in assenza di cofattori. La reazione inizia con
una rapida ciclizzazione tra la Ser65 e la Gly67 per formare un
prodotto intermedio (imidazolin-5-one) seguita da una reazione di
ossidazione della Tyr66.
La reazione è termosensibile, ma una volta prodotta la GFP è molto
stabile.
La proteina è stata cristallizzata e la sua struttura
determinata. La GFP funziona in forma dimerica la struttura
cilindrica è sostenuta da foglietti beta, le dimensioni del
cilindro sono 30 Å di larghezza e 40 Å di lunghezza ,
segmenti ad alfa elica chiudono i cilindri da ambedue le parti
e costituiscono lo scheletro per la formazione del fluoroforo
che si trova al centro dei cilindri. Questa particolare
struttura con foglietti beta esterni e alfa eliche interne
forma una nuova classe di proteine denominata beta-can. Si
tratta di una struttura molto stabile e difficilmente
degradabile.
La conoscenza della struttura ha permesso di generare una serie
di mutanti, il primo dei quali è stata una muazione puntiforme
(S65T) descritta da Roger Tsien nel 1995 che migliora le
caratteristiche dello spettro di emissione (509 nm) con una
fluorescenza più sostenuta e più stabile nel tempo e lo
spostamento del picco di eccitazione a 488 nm.
Negli anni a seguire, il gruppo di Tsien ha sviluppato una
vastissima gamma di proteine fluorescenti (YFP, EBFP, EBFP2,
citrine, Venus, ecc)
Roger Tsien, premio Nobel 2008
Imaging dell’espressione genica attraverso i
sistemi reporter. Le proteine fluorescenti
(GFP e BFP).
Citosol BFP
Golgi GFP
Luciferasi
Le luciferasi sono una classe di enzimi ossidativi che agendo su un
substrato specifico causano la produzione di fotoni ( luciferasi di lucciola,
e suoi derivati ricombinanti, Luc 2, ecc) ' (lucem ferre).
luciferina + ATP → luciferil adenilato + PPi
luciferil adenylato + O2 → ossiluciferina + AMP + fotoni
Utilizzo di proteine bioluminescenti o
fluorescenti per studi di funzione geniche,
di correlazioni-struttura-funzione, di
regolazione di espressione genica
Effetto di mutazioni specifiche sulla attività
trascrizionale
del recettore degli estrogeni
NH2-
A
AF-1
DBD
NH2-
A
AF-1
DBD
DBD
ER activity
(fold over basal)
4
3
D
AF-2
F
-COOH
:wt
:1-399
D
AF-2
F
-COOH
:182-599
NH2-
A
AF-1
DBD
D
AF-2
F
-COOH
:S122-A
NH2-
A
AF-1
DBD
D
AF-2
F
-COOH
:C241/244-A
NH2-
A
AF-1
DBD
D
AF-2
F
-COOH
:G525-R
NH2-
A
AF-1
DBD
D
AF-2
F
-COOH
:L543/544-A
2
1
*
0
aa 1 mM
**
**
**
Un esempio storico. L’analisi del promotore del gene
tk del virus Herpes simplex
-100
GC
-80
CCAAT
-60
GC
-40
-20
TATA
+1
+
+
+
+
-
Generazione
di mutanti
+ + --+-+-
Trascrizione in
oociti di
Xenopus laevis
Analisi di Northern
Studio di funzione genica:
l’esempio della identificazione
della funzione di Nip-2 e
protimosina
Prothymosin alpha (PTMA)
•
•
•
•
highly acidic polypeptide of 12,6 kDa
highly conserved among species
widely distributed among tissues
nuclear localization
involved in:
• cell cycle progression
• cell growth and proliferation
bnip-2 expression
associates to cell death
16 h 24h 48h
20
15
c
nip 0.5
nip 1.5
nip 2.5
nip2 mRNA
Cell death (dead cells/dish)x
10 2
7
6
5
4
3
2
1
0
10
5
0
• Nip-2 pro-apoptotic activity is
blocked by overexpression of Bcl-2
• mutants of nip-2 in the Bcl-2 binding
domain fail to cause apoptosis
Meda et al. 2001
0
1
4
16
24
48
Hours after Locke
TRANSFEZIONE DI bnip2/PROT-A cDNA
IN MCF-7 CELLS
BNIP2
%survival
apoptosi
100
PTMA
CTRL
50
25
0
% proliferation
proliferazione
CTRL
75
CTRL BNIP2
200
150
100
50
0
CTRL PTMA
STUDI DI STRUTTURAFUNZIONE
Greene et al. EMBO reports 8, 6, 563–568 (2007)
Applicazioni dell’ingegneria cellulare.
Analisi struttura funzione delle
proteine eucariote
RICERCA DI
BASE
APPLICAZIONI
INDUSTRIALI
Riconoscimento della funzione di una
proteina (oncogeni, geni
oncosoppressori)
Studio della regolazione
dell’espressione genica. Analisi di
mutazioni di elementi cis e trans
Screening di molecole
farmacologicamente attive (HTS)
Produzione di biofarmaci
High-throughput Screening (1)
La possibilità di automatizzare la detezione del
reporter consente uno screening ad “alto flusso”.
Library di
molecole
Saggio biologico Piattaforma
automatizzabile Robotizzata
Elaborazione
digitale dei
dati
High-throughput Screening (2)
1990. 20 ricercatori
1.5 milioni di molecole/anno
Oggi. 4 ricercatori
2.5 milioni di molecole/anno
I più moderni saggi di screening consentono la
determinazione della POTENZA e della
SPECIFICITA’ della sostanza testata.
Applicazioni dell’ingegneria cellulare.
Analisi struttura funzione delle
proteine eucariote
RICERCA DI
BASE
APPLICAZIONI
INDUSTRIALI
Riconoscimento della funzione di una
proteina (oncogeni, geni
oncosoppressori)
Studio della regolazione
dell’espressione genica. Analisi di
mutazioni di elementi cis e trans
Screening di molecole
farmacologicamente attive (HTS)
Produzione di biofarmaci
INGEGNERIA CELLULARE
TRASFEZIONE
TRANSIENTE
STABILE
Kin
RANDOM
INTEGRATION
• GENE FUNCTION
(scelta vettore; promotore;
costrutto)
• SCREENING
FARMACI
• STUDI
STRUTTURAFUNZIONE
• PRODUZIONE PROTEINE
• GENE FUNCTION
PRODUZIONE DI PROTEINE PER MEZZO DELL’
INGEGNERIA GENETICA
A cosa possono servire le proteine ricombinanti?
-proteine di interesse terapeutico.
-proteine di interesse commerciale (enzimi).
-proteine da utilizzare come antigeni per la produzione
di anticorpi policlonali e monoclonali.
-reagenti per la ricerca di base e applicata.
Produzione di biofarmaci
La produzione delle proteine terapeutiche in
microorganismi non è sempre possibile soprattutto
per le modificazioni post-traduzionali
L’utilizzo di cellule animali consente di
ottenere prodotti proteici strutturalmente più
simili al fisiologico, ma pone serie difficoltà
tecniche e costi più elevati.
MANIPOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA IN
CELLULE EUCARIOTICHE
Vantaggi rispetto a sistemi procariotici
-formazione corretta di ponti disolfuro
-folding corretto
-taglio proteolitico da precursore
-glicosilazione
-modificazione di aa (fosforilazione, acetilazione,
miristilazione, ecc.)
PROGRAMMAZIONE DI UN ESPERIMENTO DI
INGEGNERIA CELLULARE
• SCELTA DEL SISTEMA CELLULARE
• DISEGNO DEL VETTORE DI ESPRESSIONE
• MODIFICAZIONE DEL SISTEMA CELLULARE
• CLONAGGIO CELLULE CON ALTA
ESPRESSIONE, STABILITA’, SENSIBILITA’ A
OSMOLARITA’ E pCO2
• OTTIMIZZAZIONE DEL MEZZO DI COLTURA
• SCALING UP (DA 3 A 10000 L)
TPA (tissue plasminogen activator) ricombinante
Il primo farmaco ricombinante prodotto in cellule di
mammifero
Cellule CHO (Chinese Hamster Ovary)
Pregressa conoscenza nella produzione di vaccini
Assenza di attività tossica per l’uomo
Stabile integrazione di geni eterologhi
Crescita in sospensione o monostrato
Modificazioni post-traduzionali corrette
REATTORE PER CRESCITA DI CELLULE EUCARIOTE
Moreira Biopharm Int. 2007
CRESCITA DI CELLULE IN MONOSTRATO
ROLLER BOTTLES
CELL CUBES
CRESCITA DI CELLULE IN MONOSTRATO
CELL FACTORY
CRESCITA DI CELLULE IN MONOSTRATO
MICROCARRIER IN VASCHE AGITANTI
IMPIANTO DI FERMENTAZIONE
PER LA PRODUZIONE DI PROTEINE TERAPEUTICHE
Difficoltà nella produzione di biofarmaci
Istituzione di Master cell banks caratterizzate in dettaglio
per stabilità genetica, tempi di crescita, contaminazioni,
numero di copie del vettore, livello di espressione del
transgene.
Preparazione di Manufacturers cell banks sottoposte ad
ulteriore caratterizzazione prima e dopo il caricamento
nell’impianto pilota
Controllo su larga scala della stabilità nelle condizioni di
fermentazione, con la preparazione di Extended cell banks.
Controllo delle condizioni di produzione
Recupero e produzione
Caratterizzazione del prodotto
CONTROLLO
QUALITA’
Controllo di qualità di proteine
terapeutiche
Caratterizzazione della proteina
Determinazione dello stato di purezza
Saggio biologico
SDS PAGE/Western
Saggio immunologico
HPLC
SDS PAGE Western
Presenza di proteine seriche
Isoelectrofocusing
Presenza di proteine cellulari
HPLC
Presenza pirogeni
Mappa peptidica
Presenza di DNA cellulare
Sequenziamento N-terminale
Spettrometria di massa
Composizione in carboidrati
Composizione in acido sialico
Difficoltà nella produzione di biofarmaci
Istituzione di Master cell banks caratterizzate in dettaglio
per stabilità genetica, tempi di crescita, contaminazioni,
numero di copie del vettore, livello di espressione del
transgene.
Preparazione di Manufacturers cell banks sottoposte ad
ulteriore caratterizzazione prima e dopo il caricamento
nell’impianto pilota
Controllo su larga scala della stabilità nelle condizioni di
fermentazione, con la preparazione di Extended cell banks.
Controllo delle condizioni di produzione
Recupero e produzione
Caratterizzazione del prodotto
CONTROLLO
QUALITA’