CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL
FARMACO AA 2010-11
Adriana Maggi
LEZIONE 9
Ingegneria cellulare II
Applicazioni dell’ingegneria cellulare.
Analisi struttura funzione delle proteine
eucariote
RICERCA DI
BASE
APPLICAZIONI
INDUSTRIALI
Riconoscimento della funzione di una
proteina (oncogeni, geni
oncosoppressori)
Studio della regolazione dell’espressione
genica. Analisi di mutazioni di elementi
cis e trans
Screening di molecole
farmacologicamente attive (HTS)
Produzione di biofarmaci
Biological reporter:
molecules acting as surrogate,
measurable, indicators of a
given molecular event
I geni reporter
GENE
VANTAGGI
SVANTAGGI
B-Galattosidasi
(Batterica)
Ben caratterizzata, stabile,
rilevazione automatizzabile
Presenza di attività endogena in
cellule di mammifero, enzima
tetramerico (risposta non
lineare)
Luciferasi
(Lucciola)
Alta attività specifica,
mancanza di attività endogena
(basso background)
Richiede l’aggiunta di cofattore,
O2, ATP.
Fosfatasi
alcalina (Umana)
Proteina di secrezione, saggio
colorimetrico molto sensibile.
Elevata attività endogena in
alcuni tipi cellulari.
fluorescent
proteins (GFP,
varianti RFP,
BFP)
Monomerico, non richiede
substrato, assente nei
mammiferi, varianti con
diversa l di fluorescenza.
Bassa sensibilità per mancanza
di amplificazione (non è una
reazione enzimatica)
fluorescent proteins
La green fluorescent protein è una proteina naturale (prodotta dalla
medusa Aequorea victoria) di piccole dimensioni (238 aa 26,9 kd) che se
eccitata da una radiazione nel campo dell’ultravioletto (l 395 nm), ma
anche del visibile (l 475 nm, colore blu) emette una radiazione di colore
verde (505 nm)
Osamu Shimomura
Premio Nobel 2008
Fluoroforo di GFP è un tripepide Ser-deidroTyr-Gly
che è ciclizzato:
p-idrossibenzilidene-imidazolidone
Nella struttura tridimensionale della GFP alcuni residui basici
fanno ponti a idrogeno con atomi di ossigeno (His148 con Tyr66
e Gln94 o Arg96 con l’ imidazolidone.) stabilizzando il
fluoroforo
L’emissione di luce avviene tramite un meccanismo sequenziale
di un processo autocatalitico in assenza di cofattori. La
reazione inizia con una rapida ciclizzazione tra la Ser65 e la
Gly67 per formare un intermediato (imidazolin-5-one) seguita
da una reazione di ossidazione della Tyr66.
La reazione è termosensibile, ma una volta prodotta la GFP è
molto stabile.
La proteina è stata cristallizzata e la sua struttura determinata.
La GFP funziona in forma dimerica la struttura cilindrica è
sostenuta da foglietti beta, le dimensioni del cilindro sono 30 Å di
larghezza e 40 Å di lunghezza , segmenti ad alfa elica chiudono I
cilindri da ambedue le parti e costituiscono lo scheletro per la
formazione del fluoroforo che si trova al centro dei cilindri.
Questa particolare struttura con fogietti beta esterni e alfa
eliche interne forma una nuova classe di proteine denominata
beta-can. Si tratta di una struttura molto stabile e difficilmente
degradabile.
La conoscenza della struttura ha permesso di generare una serie di
mutanti, il primo dei quali è stata una muazione puntiforme (S65T)
descritta da Roger Tsien nel 1995 che migliora le caratteristiche dello
spettro di emissione (509 nm) con una fluorescenza più sostenuta e più
stabile nel tempo e lo spostamento del picco di eccitazione a 488 nm.
Negli anni a seguire, il gruppo di Tsien ha sviluppato una vastissima
gamma di proteine fluorescenti (YFP, EBFP, EBFP2, citrine, Venus,
ecc)
Roger Tsien, premio Nobel 2008
Imaging dell’espressione genica attraverso i
sistemi reporter. Le proteine fluorescenti (GFP e
BFP).
Citosol BFP
Golgi GFP
Luciferasi
Le luciferasi sono una classe di enzimi ossidativi che agendo su un substrato
specifico causano la produzione ( luciferasi di lucciola, e suoi derivati
ricombinanti, Luc 2, ecc) ' (lucem ferre).
luciferina + ATP → luciferil adenilato + PPi
luciferil adenylato + O2 → ossiluciferina + AMP + fotoni
Utilizzo di proteine bioluminescenti o
fluorescenti per studi di funzione geniche, di
correlazioni-struttura-funzione, studi di
regolazione di espressione genica
Lo studio della regolazione dell’espressione
genica. I sistemi reporter
X
Elementi di
regolazione
trans
Y
Promotore
Prodotto genico
facilmente
Z
Gene reporter
Elementi di regolazione cis
quantizzabile
Effetto di mutazioni specifiche sulla attività trascrizionale
del recettore degli estrogeni
ER activity
(fold over basal)
4
3
NH2-
A
AF-1
DBD
NH2-
A
AF-1
DBD
D
AF-2
F
-COOH
:wt
:1-399
-COOH
:182-599
F
-COOH
:S122-A
DBD
D
AF-2
F
DBD
D
AF-2
NH2-
A
AF-1
NH2-
A
AF-1
DBD
D
AF-2
F
-COOH
:C241/244-A
NH2-
A
AF-1
DBD
D
AF-2
F
-COOH
:G525-R
NH2-
A
AF-1
DBD
D
AF-2
F
-COOH
:L543/544-A
2
1
0
*
**
**
**
Un esempio storico. L’analisi del promotore del gene tk
del virus Herpes Simplex
-100
GC
-80
CCAAT
-60
GC
-40
-20
TATA
+1
+
+
+
+
-
Generazione di
mutanti
+ + --+-+-
Trascrizione in
oociti di Xenopus
laevis
Analisi di Northern
Studio di funzione genica:
l’esempio della identificazione
della funzione di Nip-2 e
protimosina
16 h
24h
bnip-2 expression
associates to cell death
48h
20
c
nip 0.5
nip 1.5
nip 2.5
nip2 mRNA
Cell death (dead cells/dish)x
10 2
7
6
5
4
3
2
1
0
15
10
5
0
• Nip-2 pro-apoptotic activity is
blocked by overexpression of Bcl-2
• mutants of nip-2 in the Bcl-2 binding
domani fail to cause apoptosis
Meda et al. 2001
0
1
4
16
24
48
Hours after Locke
TRANSFEZIONE DI bnip2/PROT-A cDNA
IN MCF-7 CELLS
BNIP2
%survival
apoptosi
100
BNIP2
CTRL
50
25
0
% proliferation
proliferazione
CTRL
75
CTRL BNIP2
200
150
100
50
0
CTRL BNIP2
STUDI DI STRUTTURAFUNZIONE
Greene et al. EMBO reports 8, 6, 563–568 (2007)
Structure of TFMPV-E2/ER ligandbinding domain. (A) The structure of one
monomer of ER is shown as a ribbon
diagram, with the bound GRIP1 coactivator
peptide coloured red. The compound is
shown in a stick representation, with
carbon atoms coloured green, oxygen
atoms coloured red and fluorine atoms
coloured pink. (B) A stereo view of part of
the ligand-binding pocket bound to
oestradiol (top panels; Protein Data Bank
code 1ERE), or TFMPV-E2 (bottom panels).
The ligands are coloured green and are
shown in a stick representation. (C)
TFMPV-E2 is shown in a 2F o–F c electron
density map, contoured to 1.5 . ER ,
oestrogen receptor ; GRIP, glutamate
receptor interacting protein; TFMPV-E2,
trifluoromethyl-substituted phenylvinyl
oestradiol compound
Greene et al. EMBO reports 8, 6, 563–568 (2007)
Applicazioni dell’ingegneria cellulare.
Analisi struttura funzione delle proteine
eucariote
RICERCA DI
BASE
APPLICAZIONI
INDUSTRIALI
Riconoscimento della funzione di una
proteina (oncogeni, geni
oncosoppressori)
Studio della regolazione dell’espressione
genica. Analisi di mutazioni di elementi
cis e trans
Screening di molecole
farmacologicamente attive (HTS)
Produzione di biofarmaci
Screening di molecole farmacologicamente
attive.
ER cDNA
LUC
Potenziali
ligandi
ER ER
LUC
LUC Units
ERE
CTR
E2
CTR
High-throughput Screening (1)
La possibilità di automatizzare la detezione del reporter
consente uno screening ad “alto flusso”.
Library di
molecole
Saggio biologico
automatizzabile
Piattaforma
Robotizzata
Elaborazione
digitale dei
dati
High-throughput Screening (2)
1990. 20 ricercatori
1.5 milioni di molecole/anno
Oggi. 4 ricercatori
2.5 milioni di molecole/anno
I più moderni saggi di screening consentono la
determinazione della POTENZA e della
SPECIFICITA’ della sostanza testata.
Applicazioni dell’ingegneria cellulare.
Analisi struttura funzione delle proteine
eucariote
RICERCA DI
BASE
APPLICAZIONI
INDUSTRIALI
Riconoscimento della funzione di una
proteina (oncogeni, geni
oncosoppressori)
Studio della regolazione dell’espressione
genica. Analisi di mutazioni di elementi
cis e trans
Screening di molecole
farmacologicamente attive (HTS)
Produzione di biofarmaci
Produzione di biofarmaci
La produzione delle proteine terapeutiche in
microorganismi non è sempre possibile soprattutto
per le modificazioni post-traduzionali
L’utilizzo di cellule animali consente di
ottenere prodotti proteici strutturalmente più
simili al fisiologico, ma pone serie difficoltà
tecniche e costi più elevati.
IMPIANTO DI FERMENTAZIONE
PER LA PRODUZIONE DI PROTEINE TERAPEUTICHE
Difficoltà nella produzione di biofarmaci
Istituzione di Master cell banks caratterizzate in dettaglio per
stabilità genetica, tempi di crescita, contaminazioni, numero di
copie del vettore, livello di espressione del transgene.
Preparazione di Manufacturers cell banks sottoposte ad ulteriore
caratterizzazione prima e dopo il caricamente nell’impianto pilota
Controllo su larga scala della stabilità nelle condizioni di
fermentazione, con la preparazione di Extended cell banks.
Controllo delle condizioni di produzione
Recupero e produzione
Caratterizzazione del prodotto
CONTROLLO
QUALITA’
Controllo di qualità di proteine terapeutiche
Caratterizzazione della proteina
Determinazione dello stato di purezza
Saggio biologico
SDS PAGE/Western
Saggio immunologico
HPLC
SDS PAGE Western
Presenza di proteine seriche
Isoelectrofocusing
Presenza di proteine cellulari
HPLC
Presenza pirogeni
Mappa peptidica
Presenza di DNA cellulare
Sequenziamento N-terminale
Spettrometria di massa
Composizione in carboidrati
Composizione in acido sialico
TPA ricombinante
Il primo farmaco ricombinante prodotto in cellule di
mammifero
Cellule CHO (Chinese Hamster Ovary)
Pregressa conoscenza nella produzione di vaccini
Assenza di attività tossica per l’uomo
Stabile integrazione di geni eterologhi
Crescita in sospensione o monostrato
Modificazioni post-traduzionali corrette
Alcuni esempi di proteine terapeutiche in commercio
TPA
Insulina
Interferone alfa
hGH
IL-2
G-CSF
FSH
Interferone beta
Eritropoietina
Glucocerebrosidasi
Fattore VII
E.Coli, CHO
E.Coli
E.Coli
E.Coli
E.Coli
E.Coli
CHO
CHO
CHO
CHO
BHK
(Baby Hamster Kidney cells)