Dipartimento di Scienze della Vita Università degli Studi di Trieste Via L.Giorgeri, 1 – Trieste, Italia DALLE MEDUSE DEL PACIFICO AL PREMIO NOBEL 2008: LA BRILLANTE STORIA DELLA GREEN FLUORESCENT PROTEIN (GFP) di Giulia Realdon Non è presente nel corpo umano e non ha usi terapeutici, eppure è una delle molecole più famose nel campo della biologia: è la GFP, la proteina fluorescente verde che ha già trovato numerose applicazioni nei laboratori di ricerca di tutto il mondo e che si presta ad averne molte di più in futuro. La sua scoperta, utilizzo e modificazione hanno valso il premio Nobel per la chimica 2008 al giapponese Osamu Shimomura insieme agli statunitensi Martin Chalfie e Roger Y. Tsien. Vediamo da dove viene questa molecola e perché è così rinomata. La GFP fu isolata per la prima volta nel 1962 da Osamu Shimomura nella medusa Aequorea victoria che vive lungo la costa occidentale del Nord America. In realtà Shimomura aveva trovato la GFP studiando un’altra proteina della stessa medusa, chiamata aequorina, che mostrava una vivida fluorescenza blu in presenza di ioni Ca++. Qualche anno dopo Shimomura scoprì che la GFP doveva la sua fluorescenza ad un cromoforo formato da tre aminoacidi della proteina stessa e non a molecole di altra natura come nei marcatori fluorescenti usati fino ad allora dai ricercatori. Inoltre la GFP non aveva bisogno di Ca++ per “brillare”, ma solo di essere illuminata con luce blu (come quella prodotta dalla aequorina) oppure con raggi UV. Nel 1988 Martin Chalfie, che lavorava sull’organismo modello Caenorhabditis elegans (un piccolo verme nematode), sentì parlare della GFP e intuì che il suo gene si sarebbe potuto utilizzare come gene reporter di espressione, cioè come gene marcatore per studiare la localizzazione e le funzioni di specifiche proteine nelle cellule viventi. Chalfie recuperò il gene per la GFP da un biologo molecolare statunitense, Douglas Prasher, che lo aveva isolato ma non aveva ottenuto finanziamenti sufficienti per continuare la sua ricerca. Nel 1994, dopo che una sua collaboratrice era riuscita a trasformare il battere Escherichia coli facendogli esprimere la GFP, Chalfie riuscì a far produrre la stessa proteina da parte di 6 specifici neuroni di C. elegans. La GFP wild type, tuttavia, presenta alcuni limiti di efficienza nel suo uso: scarsa foto-stabilità, doppio picco di eccitazione (luce blu, a 475 nm e UV, a 395 nm), difficoltà nell’assumere la corretta conformazione (folding) a 37°C. Life Learning Center - Trieste Direttore: Prof. Sergio Paoletti www.llc-trieste.it [email protected] Dipartimento di Scienze della Vita Università degli Studi di Trieste Via L.Giorgeri, 1 – Trieste, Italia A questi limiti Roger Y. Tsien riuscì ad ovviare attraverso lo studio e la modificazione delle reazioni chimiche che conducono alla produzione del cromoforo, il gruppo di tre aminoacidi responsabili dell’emissione luminosa della GFP. Modelli della GFP stile cartoon; in quello a destra è stata tolta una parte della struttura a barilotto beta per mostrare il cromoforo (disegnato in stile ball and stick). Immagine tratta da PDB 1GFL. Si tratta del tripeptide Serina-Tirosina-Glicina situato nelle posizioni 65-67 della catena aminocidica della proteina, il quale matura (ossia diventa fluorescente) attraverso una reazione di ciclizzazione, seguita da disidratazione e ossidazione. Tsien, modificando diversi aminoacidi della GFP, riuscì ad ottenere una fluorescenza più brillante nel verde ed in colori diversi dello spettro, quali azzurro cyan, blu e giallo. Rimaneva da ottenere un marcatore fluorescente rosso, prodotto in seguito dal gruppo di Tsien e da altri gruppi di ricerca partendo da una proteina differente. E’ il caso di ricordare che questi marcatori sono molto meno tossici di quelli tradizionali (fluoresceina e rodamina). Oggi la tavolozza dei marcatori fluorescenti derivati dalla GFP permette di ottenere delle immagini biologiche molto belle e variopinte, oltre che ricche di informazioni. Nel mosaico di immagini qui sotto (sezioni di tessuto cerebrale), suggestivamente battezzato “brainbow”, si possono distinguere i diversi neuroni ed i loro prolungamenti in base al colore dei marcatori. Immagine tratta da: J Livet et al, Nature, 2007, 450, 56 Life Learning Center - Trieste Direttore: Prof. Sergio Paoletti www.llc-trieste.it [email protected] Dipartimento di Scienze della Vita Università degli Studi di Trieste Via L.Giorgeri, 1 – Trieste, Italia Al di là degli aspetti estetici l’importanza della GFP e delle molecole da essa derivate è quella di essere importanti strumenti molecolari dai molteplici usi. Oltre a quello già citato di reporter di espressione a bassa tossicità, ricordiamo anche quello di bio-sensore, ad esempio: -per l’individuazione di arsenico nell’acqua dei pozzi attraverso batteri resistenti all’arsenico e modificati in modo da esprimere la GFP in presenza dell’elemento tossico; -per l’individuazione di metalli pesanti (cadmio, zinco) o dell’esplosivo TNT (trinitrotoluene), sempre utilizzando batteri modificati. Resta ancora da scoprire (2008) la funzione fisiologica della GFP nella medusa da cui è stata isolata; nel frattempo il premio Nobel 2008 ci ricorda l’importanza della ricerca di base, motivata dal solo desiderio di conoscere. Spesso le ricadute della stessa vanno ben al di là delle previsioni e delle aspettative degli stessi ricercatori. Per approfondire sul web: http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/press.html: pagina del sito ufficiale della fondazione Nobel dedicata al premio per la chimica 2008-10-28 http://en.wikipedia.org/wiki/Green_Fluorescent_Protein: pagina di Wikipedia sulla GFP http://www.pianetachimica.it/mol_mese/mol_mese_2003/06_Proteina_GFP/Proteina_GFP_1_ita.htm: pagina sulla GFP di Worldwide Protein Data Bank tradotta in italiano Life Learning Center - Trieste Direttore: Prof. Sergio Paoletti www.llc-trieste.it [email protected]