Clonaggio all’interno di vettori
20-X-06
I vettori sono delle molecole di DNA che servono da tramite
per diverse funzioni a seconda dello scopo di utilizzazione
Vettori sono i plasmidi, i virus, costrutti del tutto sintetici
provenienti dall’assemblaggio di frammenti provenienti
da altri vettori o da strutture genomiche clonate e subclonate
Strutture cis : origine di replicazione, promotori, siti di splicing
e di poliadenilazione
Strutture trans : geni per la selezione, reporter ( gal, GFP,
CAT cloramfenicolo acetyltransferase)
Clonaggio dal grande al piccolo
The view was cobbled together from 165
images taken by Cassini's wide-angle
camera over 3 hours on 15 September.
The colour differences have been
exaggerated.
Giovanni Domenico Cassini
San Remo 8 Giugno 1625
Parigi 14 Settembre 1712
Professore a Bologna e direttore dell’osservatorio di Panzano e poi Parigi
I meglio scienziati italiani finiscono
all’estero: G.D. Cassini se la cavò bene
Analogia tra i satelliti di Saturno frantumati che hanno
originato gli anelli
plasmidi in cui si clonano
frammenti di genoma
Clonaggio e subclonaggio: dal
grande al piccolo
Plasmide
con inserto
PM
3 forme
relaixed
coiled
supercoiled
Plasmide pBR322
Trasfezione di cellule
competenti di batteri E.coli
ed isolamento dei batteri
resistenti all’ampicillina
Evoluzione verso PUC 18 -19
e fagemidi (fago f1)
screening di colonie bianche e bleu
ori f1
single strand x sequenziamento
mcs multiple
cloning site
2.6 kb
Vettori di espressione
Oltre alle strutture di:
crescita
selezione
clonaggio
Strutture per l’espressione: promotore per trascrizione
mcs con + reading frames
Diversità dell’espressione batterica ed eucariotica
diversità delle strutture necessarie
(capping, polyA)
Tutte le altre applicazioni
Esempi infiniti
I vettori servono nelle migliaia di applicazioni che si sono
prospettate con l’aumento della conoscenza nella biologia
Sistema elementare
di base in cui inserire il
cDNA
per la fusione con lac Z
This common eukaryotic expression vector, pSV40b
expresses the full-length b-galactosidase gene under
the control of simian virus 40 (SV40) early promoter.
This vector is very useful for transfection of
mammalian cells in culture and for use in other
species. The b-galactosidase enzyme expression is
enhanced by elements including: SD/SA-RNA splice
donor and acceptor sequence, and SV40 late
polyadenylylation signal. pSV40b expression vector
also contains b-lactamase, which acts as a selection
marker (100 mg/ml ampicillin resistance) in E. coli
host. See also our pCMVb vector system, Product
M0951.
espressione di un micro RNA
(emerald green fluorescent protein)
Seq. retrovir. x integraz.
Vettore per interferenza
L’interferenza avviene per effetto di un enzima “dicer”
che serve come difesa da RNA virali (forse anche altro)
Espressione di emerald GFP
B) Cells were specifically transfected with
Lipofectamine™ 2000 reagent at an
expected 50% efficiency to demonstrate
the 100% tracking of EmGFP and miRNA
expression. After 48 hours, cells were
stained with Hoechst nuclear stain which
stains all cells, stained with a red lamin
stain, and monitored for GFP expression.
Nearly half of the cells highly express the
lamin protein. When cells expressing
EmGFP and lamin A/C stained are
combined, it is clear that cells expressing
GFP do not appear to have lamin A/C
present, and cells stained red for lamin A/C
do not appear to have any GFP
expression. This demonstrates that cells
expressing EmGFP are also all greatly
reduced in lamin expression due to the
presence of the miRNA that is cocistronically expressed.
Come si trasfetta
efficienza
La trasfezione efficiente necessaria per il clonaggio
Trasfezione con sistema chimico
permeabilizzazione delle membrane con ioni Ca
elettroporazione
infezione con vettori virali
molecole cationiche fondono in membrana
(lipofectamine)
Sistemi semplici + tossici / minor efficienza
Sistemi complessi (vettori virali) / maggior efficienza
complicati da maneggiare / efficienza di impacchettamento
rischio di riattivazione virale