Possibile programma
Corso di ingegneria genetica
finalità dell’Ingegneria genetica
applicazioni di metodologie per lo studio della genetica :
metodi e tecniche per lo studio della struttura
metodi e tecniche per lo studio di funzione
la struttura necessaria per svolgere la funzione
interpretazione della struttura per la funzione del
GENOMA
che cosa è un metodo sperimentale,
validazione tramite uso dei controlli adeguati
Programma I
Definizione: non fa parte della bio-genetica (sapete cosa
sia la biogenetica? )
Scopi : non per studiare la bio-genetica, ma la genetica,
la genetica dello sviluppo, il genoma, l’evoluzione,
l’espressione genica, rapporto fenotipo/genotipo
In 2 parole : struttura e funzione dei genomi
Uso del DNA “RICOMBINANTE” non derivato da “crossing-over”
Cosa si deve sapere: - cosa sono le mappe genetiche
- enzimi di restrizione
- cosa è un gene
- regolazione dei geni
- analisi di mappa tramite Southern b.
- analisi dell’espressione tramite Northern b.
- anticorpi monoclonali, ELISA, Western b.
Programma II
Cosa vuol dire clonare, perché si clona
- Differenza tra clonaggio di cellule e clonaggio di sequenze
di DNA, l’RNA non si clona direttamente.
- vettori di clonaggio, sono diversi per gli scopi per cui si
usano, possono essere adattati:
- strutture dei vettori
- vettori per sequenziamento o subclonaggio
- vettori per espressione
- vettori combinati per trasfezione in cellule eucariotiche
(uso di geni reporter)
Analisi diretta sul DNA tramite PCR
- amplificazione del DNA da qualunque (quasi)
materiale biologico
Programma III
Manipolazione degli acidi nucleici
Analisi in Silicio, in vitro, in vivo
in silicio:
cercare sequenze di DNA in banca dati: per analogia,
per funzione,
per specie e fila,
per identità
banche dati per categorie: genomiche, EST, cDNA, micro RNA,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
uso di parole chiave
Dal “silicio” al “vitro”: in vitro veritas
Tecnica universalmente più diffusa : PCR
Programma IV
Cosa è la PCR : scelta sequenza ampliconi, primers, condizioni
Come funziona (amplificazione)
Come e dove si applica, a cosa si applica, con quali scopi
Come per altre tecniche
applicazioni per lo studio di struttura
applicazioni per studi di funzione
Struttura e regolazione del genoma
< sistema bidirezionale >
La struttura regola ed è regolata
Diverse vie di regolazione: modello Jacob-Monod
“genomica e post genomica” : nuovi
modelli compatibili, strutturistica
Programma V
Quali varianti della PCR ci possono essere
PCR - quantitativa, Real time, diagnostica (microbiologia)
- semiquantitativa competitiva, Real time
RT-PCR RT = reverse transcriptase, diversa da RT-PCR
intesa come PCR (real time)
Nested PCR
R.A.C.E.
AFLP PCR per studiare polimorfismi (foot-printing) ≠ da SNPS
CHIP chromosome immune precipitation
PCR per mutagenesi = costruzione di sequenze mutate
inserzioni delezioni sostituzioni
Programma VI
I controlli per la verifica sperimentale
Preparazione dei protocolli sperimentali
Procedure controllate
Che vuol dire controllo
A che servono
Come si fanno
Si devono fare per ogni tecnica sperimentale (ripetibile)
Programma VII
Studio in vitro ed in vivo, stessi approcci:
Metodi e applicazioni per il blocco di funzione
Metodi e applicazioni per stimolazione di funzione
Blocco di funzioni “cis” strutturale
Blocco di funzione “trans” codificante
Metodi con interruzione diretta o con interferenza indiretta
Vettori per ottenere questi obbiettivi
Programma VIII
Vettori per studi in vitro
Vettori per studi cellulari in vivo: diversi tipi di promotori
costitutivi, inducibili, tessuto specifici;
Vettori per organismi transgenici
Stesse finalità per tutti : inattivazione di funzione
stimolazione di funzione
Programma IX
Espressione e trascrizione
inattivazione tramite : RNA,
interference,
PNA (peptide nucleic acids),
Ricombinazione omologa e knock-out di funzione
Ricerca dei fattori che legano e interagiscono
con gli Acidi nucleici (EMSA, CHIPS)
con altre proteine (doppio ibrido con vettori specifici)
Programma X
Organismi transgenici
Inserimento di nuove funzioni
Blocco di funzioni endogene
Diversi tipi di vettori i diversi tipi di transgenia
Uso dei diversi modelli animali: Modelli murini,
Vari tipi di transgenia : diretta e con cellule staminali embrionali
Cosa si può studiare con i topi transgenici
scopo di ogni tipo di topo transgenico,
applicazioni con obbiettivi diversi
(espressione, K.O. > gene trap)
Programma XI
Dalla genomica approcci globali, olistici
Conoscenza globale del genoma
di animali modello
di animali commerciali
Analisi della struttura per interpretare la funzione
EMSA, CHIP, Chips
Ripensamento sul DNA non codificante
Funzioni del DNA non codificante
(mantenimento e variabilità) importanza dei polimorfismi
uso dei polimorfismi, come si studiano e perchè
Tipi di DNA non codificanti,
studio delle modificazioni epigenetiche
Programma XII
Avete trovato elementi contraddittori con la teoria
Evoluzionistica Darwiniana,
Ci sono elementi per sostenere ipotesi Lamarkiane
In che maniera l’ambiente influenza e modifica il genoma
Come si può studiare
Fenomeni epigenetici confliggono con i postulati ?