ENZIMI DI RESTRIZIONE
Reazione
ligasica di
frammenti di
restrizione
Fig 4.20 separation of poly-A
mRNA
mRNA Purification
1. Total RNA Purification
2. PolyA+ RNA purification using
oligo(dT)
Gubler Hoffman cDNA Synthesis - 1
mRNA
primed mRNA
AAAAAn
Anneal oligo dT primer
AAAAAn
TTTTT
Reverse Transcriptase
and dNTPs
mRNA/cDNA
hybrid
AAAAAn
TTTTT
Gubler Hoffman cDNA Synthesis - 2
mRNA/cDNA
hybrid
AAAAAn
TTTTT
RNase H
nicked RNA
AAAAAn
TTTTT
DNA Pol I
nicked RNA used
as primers by Pol
AAAAA
TTTTT
Gubler Hoffman cDNA Synthesis - 3
2nd strand cDNA
in pieces
AAAAA
TTTTT
E. coli DNA
Ligase
AAAAA
TTTTT
ds cDNA
Clone into vector
cDNA Library
cDNA synthesis
TTTTTTTTT
First strand
Nick translation
cDNA library
Vettori e clonaggio
Vettori
Plasmidi
Fagi
Cosmidi
YAC
Vettori e clonaggio
Plasmide
Molecola circolare di DNA a doppio
filamento, normalmente presente
nella cellula batterica, in grado
di replicarsi autonomamente
dal cromosoma.
VETTORI DI CLONAGGIO
Vettori e clonaggio
Replicazione di un plasmide
INSERIMENTO DI UN TRATTO DI DNA ESOGENO
IN UN VETTORE DI CLONAGGIO
CLONAGGIO:
-TRASFORMAZIONE
-SELEZIONE
-CRESCITA COLONIE
IDENTIFICAZIONE
DELLA COLONIA
BATTERICA DI INTERESSE
Bromo-chloro-indoyl--galactopyranosidase or X-Gal (Clear)
-galactosidase
Bromo-chloro-indoyl (Deep blue insoluble)
+
galactose
Inserting chromosomal DNA into a vector
Chromosome
GAATTC
CTTAAG
Vector
GAATTC
CTTAAG
GAATTC
CTTAAG
Cut with EcoRI and add DNA ligase
Recombinant vector
GAATTC
CTTAAG
GAATTC
CTTAAG
Ampicillin resistant; -galactosidase negative (White on X-Gal)
LacZ gene codes for -galactosidase
Ampicillin resistance gene
Bacteria from ligation plated
on ampicillin and X-Gal
Contains
wild type
plasmd
Contains
recombinant
plasmd
Vettori e clonaggio
Vettori e clonaggio
Lunghezza massima del
DNA clonabile in un plasmide:
circa 20 Kb
Vettori e clonaggio
I virus sono piccoli parassiti
non in grado di replicarsi.
Dopo aver infettato una
cellula-ospite utilizzano i suoi
sistemi di replicazione e sintesi
delle proteine per riprodursi
Vettori e clonaggio
I batteriofagi (o fagi) sono virus
che infettano i batteri.
Vettori e clonaggio
Ciclo litico del fago T4
Vettori e clonaggio
Il fago più utilizzato in biologia
molecolare è il fago 
Vettori e clonaggio
Ciclo
litico e
lisogenico
del fago 
Vettori e clonaggio
Assemblaggio
di un fago 
Vettori e clonaggio
Mappa del genoma del fago 
Vettori e clonaggio
Clonaggio di
frammenti di
DNA nel
fago 
Vettori e clonaggio
Formazione di cloni fagici
Vettori e clonaggio
L’infezione dei batteri con il fago 
è circa 103 volte più efficiente
della trasformazione
con un plasmide
Vettori e clonaggio
Lunghezza del DNA
clonabile in un fago:
20-25 Kb
Vettori e clonaggio
Un cosmide è un plasmide
contenente la sequenza COS
dal fago 
Vettori e clonaggio
Vettori e clonaggio
Clonaggio di
frammenti di
DNA in un
cosmide
Vettori e clonaggio
Lunghezza del DNA
clonabile in un cosmide:
circa 45 Kb
EcoR I
Infect cells
Genomic Library
AAAAAA
AAAAAA
AAAAAA
AAAAAA
AAAAAA
AAAAAA
AAAAAA
AAAAAA
AAAAAA
AAAAAA
AAAAAA
AAAAAA
AAAAAA
AAAAAA
AAAAAA
AAAAAA
AAAAAA
AAAAAA
cDNA synthesis
cDNA library
Infect cells
Genomic Library Construction
• Preparing the insert
– Partial digestion preferred
Ligation to vector
Genomic library
cDNA library
Source
Genomic DNA
mRNA
Variation
Species or strains
Species or strains
Tissues
Developmental stages
Insert size
12k -- 20k
0.2k -- 6k
Representation
Equal
Correlate with
expression level
Type
Only one
Expression vs. non
expression
Probe
DNA
DNA or antibody or
protein
Purpose
Gene structure
Infer protein identity
Encoded protein
Infer protein identity
Screening a eukaryotic gene
library
• Homologous gene from other organism
– Mammalian genes are very similar
– Thus if trying to get human gene screen with the
equivalent gene from another organism
– Oligonucleotide based on protein sequence or
known sequence of homologous gene
– Purify protein and determine sequence
– Build a nucleotide sequence which codes for
protein sequence
Amino acid sequence
Met-Asn-Lys-Trp-Glu-Met
Met = ATG; Asn = AAT or AAC; Lys = AAA or AAG;
Trp = TGG; Glu = GAA or GAG
How many probes must we make?
ATG AAT AAA TGG GAA ATG
ATG AAT AAA TGG GAG ATG
ATG AAT AAG TGG GAA ATG
ATG AAT AAG TGG GAG ATG
ATG AAC AAA TGG GAA ATG
ATG AAC AAA TGG GAG ATG
ATG AAC AAG TGG GAA ATG
ATG AAC AAG TGG GAG ATG
CLONAGGI MULTIPLI
VETTORI DI ESPRESSIONE
PROTEINE DI FUSIONE
PRODUZIONE DI LIBRERIE
Screening the Library
ATTAGCGCCTTTACGCA
……………………TAATCGCGGAAATGCGT…………
Screening with DNA probe
• Probe is identified
cloned
– From other organism
– Same organism
• Looking for variants
• Chromosome walk
Chromosome walk
cDNA library
Clone cDNAs
Expression
vector
Screen for gene of interest based on activity or antibodies
Genome Projects
• Whole genome
sequencing
• Fragment and clone
• Sequence ALL clones!
• Computer assembles
Bee
Cat
Chicken
Cow
Dog
Fruit fly
Human
Malaria parasite
Microbial Genomes
Mosquito
Mouse
Nematode
Pig
Plant Genomes Central
Rat
Retroviruses
Sea urchin
Tribolium
Sheep
Zebrafish
Genome Projects
• Multiple organisms provide suitable
systems for experimentation
–
–
–
–
Zebrafish-development
Rat-physiology
Dog- genetic disease
Fruit fly- behavior
• Some of practical significance
– Mosquito/Malaria parasite
Il metodo Sanger
(o metodo a terminazione di catena)
1) Il sequenziamento a terminazione di catena coinvolge la sintesi di
nuovi filamenti di DNA, complementari ad uno stampo a singolo
filamento
Per la sintesi del DNA si utilizzano DNA polimerasi caratterizzate da
•Elevata processività
•Bassa attività esonucleasica 5’-3’
•Bassa attività esonucleasica 3’-5’
(es. Klenow, Sequenasi)
(1) Produzione dello stampo a filamento singolo
Utilizzo
della PCR
Utilizzo di un fago helper
Per M13 e produzione della
Forma a singolo filamento
Utilizzo di
fagemidi
Denaturazione del vettore
Il metodo Sanger
(o metodo a terminazione di catena)
Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad
1) Uno stampo a singola elica
ha bisogno di:
2) un innesco specifico (primer)
3) La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con
35S
(2,3) Sintesi del filamento marcato
PRIMER
DNA Polimerasi
5’-A T C T T T T A G A GT A C C
3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’
PRIMER
5’-A T C T T T T A G A GT A C C T G AG*AGAT GA T AG*A DNA Polimerasi
3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’
Il metodo Sanger
(o metodo a terminazione di catena)
Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad
1) Uno stampo a singola elica
2) un innesco specifico (primer)
3) La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con
35S
ha bisogno di:
4) una miscela di ddNTP, uno per ogni reazione di sequenza
Terminazione della catena
La sintesi del filamento compementare, tuttavia non prosegue
indefinitivamente, perché la miscela di reazione contiene, in quattro
distinte reazioni piccole quantità di specifici dideossinucleotidi
trifosfati, ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP, che bloccano l’allungamento perché
posseggono un solo atomo di idrogeno al posto del gruppo -OH in 3’
PRIMER
5’-A T C T T T T A G A GT A C C T G AG*AGAT GA T AG*A DNA Polimerasi
3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’
+ ddNTP ( per es. ddCTP)
STOP
5’-A T C T T T T A G A GT A C C T G AG*AGAT GA T AG*AT G T AddC
3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’
Il risultato è una serie di frammenti interrotti ciascuno
in corrispondenza di ogni dCTP
ddCTP
ddCTP
ddCTP
ddCTP
ddCTP
ddCTP
Schema di sequenziamento a terminazione di catena
DNA stampo a
singola elica
3’-GGCTAAC
5’
Ibridazione con
Il primer
3’
3’-GGCTAAC
+
[35S]dATP+dCTP,dGTP,dTT (dNTP) +Sequenasi
ddATP, dNTP
ddCTP, dNTP
-CCG ddA
-ddC
-C ddC
A C
ddGTP, dNTP
ddTTP, dNTP
-CC ddG
-CCGATT ddG
G
-CCGA ddT
-CCGAT ddT
T
-CCGATT ddG
-CCGAT ddT
-CCGA ddT
-CCG ddA
-CC ddG
-C ddC
-ddC
G
T
T
A
G
C
C
Sequenza: 5’-CCGATTG
Direzione di
lettura
Nuovi metodi di sequenziamento
Il sequenziamento a ciclo termico ( PCR asimettrica)
Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti
Il sequenziamento a ciclo termico ( PCR asimettrica)
DNA stampo
PCR con un solo primer
ddATP
ddA
ddA
ddA
ddA
ddA
Vengono effettuate 4 rezioni di PCR, ognuna contiene un solo primer e uno dei 4
dideossi nucleotidi trifosfati. Si generano le consuete famiglie di filamenti a catena
terminata che vengono risolti per elettroforesi su gel di poliacrilammide
Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti
Coniugando a ciascun ddNTP
un diverso marcatore fluorescente, è
possibile effettuare le quattro reazioni di
sequenziamento in un unico tubo da saggio
e caricare il tutto in solo pozzetto di gel
ddA
ddT
ddC
ddG
Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e le
informazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colore
diverso, con aree proporzionali all’intensità di emissione.
Fluorescent DNA Sequencing
AGTAC T G G GAT C
Gel
Electrophoresis
Detection of Fluorescently Tagged
DNA
DNA Fragments
Separated by
Electrophoresis
Optical
Detection System
Scanning Laser
Excites
Fluorescent Dyes
Output to Computer
Fluorescent DNA Sequencing
Data
Fluorescent DNA Sequence Trace
Size of gene library
N = ln(1-P)
ln (1-A/B)
N = Number of clones
P = 95 % probability of finding gene
A = Average size of DNA fragments
B = Total size of genome
E. coli has genome of 4,800,000 nucleotides
Average size of insert is 10,000 nucleotides
Number of clones for 95 % probability is 1700
Size of gene library
• If genome is large e.g. human genome
(3
x 109) then number of clones to make library
becomes unrealistic (1058000) if using a
plasmid vector (accepts only 10 kb as larger
DNA can’t be transformed)
• Therefore need to use vectors that can
accept larger pieces of DNA
– I.e. if each vector contains a large piece of DNA
you don’t need so many clones to make a gene
library
What vectors for what
libraries?
Vector
Plasmid
Insert
size
<10 kb
Lambda phage 18-25 kb
Cosmid
YAC etc
What libraries
Bacteria
Yeast
34-45 kb
Intermediate
eukaryotes
0.1 – 1 Mb Higher Eukaryotes
Human library requires >1,000,000 plasmid clones
Human library requires 14000 YAC clones
Vettori e clonaggio
YAC=yeast artificial chromosome
Vettori e clonaggio
Dimostrazione
sperimentale
degli elementi
funzionali di
un cromosoma
Vettori e clonaggio
Vettore YAC:
sequenze ARS
CEN
TEL
Vettori e clonaggio
Vettori e clonaggio
Lunghezza del DNA
clonabile in uno YAC:
fino a 1000 Kb
Vettori e clonaggio
Approximate Maximum Length of DNA That Can
Be Cloned in Vectors
Vector Type
Cloned DNA (kb)
Plasmid
20
λ phage
25
Cosmid
45
P1 phage
100
BAC (bacterial artificial chromosome)
300
YAC (yeast artificial chromosome)
1000
Whole Genome Shotgun
• Celera Genomics
Fragment and sequence entire genome
Each fragment is sequenced completely and then these pieces are
aligned to one another by a computer, based on overlapping
sequence between fragments.
Overview of Facts Asserted
• 2.91 billion base pairs (bp)
• 1.1% exons, 24% introns, 75% intergenic
DNA
• 2.1 million single nucleotide
polymorphisms (SNP’s)
• less than 1% of all SNP’s reflected changes
in proteins
Structure of the genome
http://genome.ucsc.edu
http://www.ncbi.nlm.nih.gov