Terapia Genica Terapia cellulare • Allotrapianto: cellule provenienti da un donatore della stessa specie • Autotrapianto: cellule provenienti dallo stesso paziente • Xenotrapianto: cellule provenienti da animali di specie diverse Strategie terapeutiche genetico-molecolari • Produzione di proteine normali in diversi sistemi di espressione (batteri, lieviti, cellule in coltura, animali geneticamente modificati). • Produzione di anticorpi geneticamente modificati. • Produzione di vaccini geneticamente modificati. • Terapia genica. Terapia genica Insieme di procedimenti atti a a curare o ad alleviare una malattia modificando geneticamente le cellule dei pazienti. Può essere in vivo o ex vivo Vantaggi teorici della terapia genica • Correzione radicale dei difetti • Possibilità di agire su meccanismi molecolari per i quali risulta estremamente difficile sviluppare farmaci specifici • Vantaggi economici (se è permanente eviterebbe la necessità di trattamenti ripetuti) Possibili limitazioni della terapia genica • Mancanza di necessità per disponibilità di terapie alternative • Mancanza di efficacia • Grandi problemi tecnici • Costi • Effetti indesiderati (espressione non regolata, mutagenesi inserzionale, passaggio delle modifiche alla linea germinale) Attuali problemi tecnici della terapia genica • Efficienza di trasferimento (vettori virali migliori di non virali) • Selettività del sistema di trasferimento • Espressione instabile nel tempo • Espressione non regolata • Reazioni del sistema immunitario • Problemi etici Quando si può pensare di curare una malattia con la terapia genica? • Malattia pericolosa per la vita, ma dagli effetti potenzialmente reversibili. • Gene clonato. • Disponibile sistema di trasferimento genico efficiente per le cellule affette, che garantisca espressione stabile nel tempo. • Non richiesta regolazione precisa del gene in questione. Strategie terapeutiche Incremento della dose genica Efficace per le patologie caratterizzate da perdita di funzione totale o parziale di un gene (ad esempio patologie autosomiche recessive o autosomiche dominanti caratterizzate da aploinsufficienza) Strategie terapeutiche Correzione mirata della mutazione genica Necessaria per le patologie causate dalla presenza di un prodotto genico alterato, che agisce attraverso un meccanismo dominante o dominante-negativo. Efficace anche nel caso di una perdita di funzione. Strategie terapeutiche Inibizione mirata dell’espressione genica Strategia utile per le patologie causate dalla presenza di mutazioni ad effetto dominante o dominante negativo. Strategie terapeutiche Inibizione mirata dell’espressione genica RNAi Inibizione mirata dell’espressione genica RNA-interference RNAi Inibizione mirata dell’espressione genica Ribozimi RNAi Strategie terapeutiche Uccisione diretta di cellule patologiche Strategie terapeutiche Uccisione di cellule patologiche mediata dal sistema immunitario Come faccio entrare il DNA nelle cellule, e cosa gli succede quando è entrato? Vettori non virali Integrazione casuale Integrazione sito-secifica Vettori virali Vantaggi dei vettori virali • Alta efficienza di trasduzione Svantaggi dei vettori virali • Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti nell’ospite • Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma) • Molecole di DNA di dimensioni limitate • Reazioni immunitarie • Costi elevati Vantaggi dei vettori non virali • Impossibile la generazione di nuovi virus patogeni • Riduzione del rischio di reazione immunitaria • Possono trasferire molti tipi diversi di molecole, e permettono di trasdurre molecole di DNA anche molto grandi • Bassi costi di produzione • Possibilità di produzione in grandi quantità Svantaggi dei vettori non virali • Scarsa efficienza • Se si usano molecole di DNA a doppio filamento anche questi vettori ossono dare mutagenesi inserzionale Vettori non virali Liposomi Vettori non virali Endocitosi mediata da recettore Vettori non virali Elettroporazione e altri metodi fisici (shotgun) Cosa si può far entrare nelle cellule con vettori non virali • • • • Plasmidi Molecole di DNA a doppio filamento lineari Oligonucleotidi DNA Oligonucleotidi RNA (varie modificazioni chimiche, come i gruppi morfolino) • Ribozimi • Polipeptidi Vettori virali In tutti i casi si tratta di virus difettivi, che possono essere prodotti solo grazie a particolari linee cellulari capaci di complementare i difetti del virus. In ogni caso la loro preparazione deve seguire queste fasi obbligate: 1.Costruzione del genoma ricombinante 2.Trasfezione del DNA nella linea cellulare capace di produrre le particelle virali 3.Raccolta e analisi del virus 4.Trattamento del paziente Vettori virali: caratteristiche principali •Retrovirus : possono infettare solo di cellule in divisione e si integrano stabilmente in maniera casuale. •Lentivirus : derivati del virus dell'HIV, possono infettare cellule quiescenti e si integrano stabilmente in maniera casuale. •Adenovirus: esprimono ad alti livelli, non si integrano stabilmente e danno grosse reazioni immunitarie. •Virus adeno-associati (AAV): integrazione sito specifica ed espressione stabile nel tempo, difficile produrli ad alto titolo. •Herpes simplex: infezione molto selettiva dei neuroni, ma importanti effetti citotossici. Retrovirus •Enveloped virus •RNA genome (2 copies) •dsDNA enters into the nucleus and integrates upon mitosis •Enters the cell by fusion •LTR: viral transcription, polyad., replication, integration Vettori retrovirali amphotropic Gag Pol Env Gag Pol Env LTR LTR encapsidation cell line Psi - Psi - ecotropic-MoMulv LTR ADA Psi + plasmid transfection Trial clinico per deficit ADA Retrovirus Trial on 2 ADA patients. Started 1990. 2 years treatment. Results published in 1995 Science, Blaese et al Retrovirus Ex-vivo Retrovirus-med. gene therapy: SCIDXI trial 1998, A. Fisher France • Recessive disease • X linked • Defect in the gc gene, receptor for cytokines => block in T and NK differentiation • Ex-vivo gene therapy on CD34+cells: MuLV- gc 20x106 cells/Kg Retrovirus A. PCR: detection of gc DNA B: RT PCR Detection of gc RNA Lymphocyte subsets protein expression Retrovirus • Genoma di RNA singolo filamento. • Possono infettare solo cellule proliferanti • Integrazione casuale nel genoma. • Difficle produrli in grandi quantità (titolo elevato). • Successo della terapia dipendente dalla trasduzione delle stem cells. • Poco immunogeni. • L’espressione può andare incontro ad attenuazione nonostante la persistenza del virus nel genoma. • In assoluto sono vettori più utilizzati per la terapia genica. Come infettare le cellule post-mitotiche? Lentivirus (HIV-1) Nuclear transport dependent • Int (MA, Vpr) • cPPT-DNA flap ? Oncoretrovirus X Mitosisdependent Lentivirus (HIV) • Genoma complesso: – geni strutturali gag pol env – geni regolatori tat rev – geni accessori nef vpr vpu vif • Tropismo per linfociti e macrofagi • Infezione persistente / malattia cronica progressiva Lentivirus • Particelle virali ibride difettive per la replicazionecostituite da: – Un set minimo di proteine del core derivate da HIV-1 – Il pericapside di un virus non correlato (VSV or MLV) – Un genoma contenente: • una cassetta di espressione per il transgene • affiancata da sequenze cis-regolatorie di HIV-1 • non sono presenti geni virali Lentivirus: costruzione Costrutto di trasferimento RSV GA RRE TRANSGENE GAcPPT RRE PROMOTORE PROMOTER GFP SD SA sequenze attive in cis LTR Provirus HIV-1 LTR U GAG VIF PRO POL RRE ENV R TAT NEF NEF REV SD sequenze attive in trans Costrutto d’incapsidazione CMV SD GAG RRE PRO POL TAT REV polyA Vettore lentivirale di ultima generazione CMV CMV GAG RRE PRO polyA POL Costrutti d’incapsidazione SD SA CMV CMV VSV-G SD RSV GA RRE GAcPPT RRE hPGK PROMOTER GFPeGFP SD RSV REV polyA SA SA Wpre polyA Costrutto codificante il pericapside Costrutto di trasferimento SIN (Self-inactivating) Produzione del vettore VSV-G polyA CMV SD CMV GAG RRE PRO polyA POL SA Envelope RSV TAT REV SD SA SD Wpre SA Costrutto di trasferimento Costrutto di incapsidazione Trasfezione transiente Cellule 293T Cellule HeLa GA RRE cPPT hPGK eGFP GA RRE PROMOTER Titolazione per diluizioni seriali Raccolta a 24 e 48 ore Concentrazione per ultracentrifugazione Lentivirus GFP expression 3 months after injection Lentivirus Control ALB promoter CMV promoter Lentivirus • Genoma ad RNA. • A differenza degli altri retrovirus possono infettare cellule proliferanti e post-mitotiche. • Integrazione casuale (mutagenesi inserzionale) • Scarsissime reazioni immunologiche. • Elevata efficienza di trasduzione. • Ottime prospettive per la terapia genica in vivo. Adenovirus Adenovirus Adenovirus MLP E1 ITR Late genes (L1-L5) E3 VA 10 20 30 40 50 60 70 IVa2 (E2F.RE)2 E2 E1 mediated regulation E4 mediated regulation E2 mediated regulation 80 ITR 90 100 E4 3.6 kb Vettori adenovirali E1 MLP Transgene 10 ITR Late genes (L1-L5) E3 VA 20 30 40 50 60 70 80 ITR 90 100 E4 E2 E1 293 cells ITR 3.6 kb Vettori adenovirali Sviluppo di nuove generazioni di vettori allo scopo di riudrre immunogenicità e aumentare le dimensioni degli inserti. Adenovirus • Genoma di DNA doppio filamento. • Possono infettare cellule proliferanti e post-mitotiche. • Non si integrano, ma vengono mantenuti in forma episomica. Pertanto non determinano mutagenesi inserzionale, ma sono necessari trattamenti ripetuti. • Relativamente facile produrli in grandi quantità (titolo elevato). • Forti reazioni immunologiche. Ciclo vitale degli AAV Fase latente Fase litica Ad Ad Integrazione sito-specifica Replicazione AAV ITR ITR Rep Integration Packaging Rescue DNA replication Integration Rescue Cap Capsid proteins VP1, VP2, VP3 AAV, preparazione AAV, infezione di neuroni Vettori adeno-associati (AAV) • Genoma di DNA singolo filamento. • Virus difettivo che richiede per la produzione la contemporanea presenza di un adenovirus. • Possono infettare cellule proliferanti e postmitotiche. • Facile produrli in grandi quantità • Integrazione sito specifica in un unico locus innocuo (Cr.19), quindi assenza di mutagenesi inserzionale. • Espressione stabile nel tempo. • Inserti di dimensioni limitate. • Efficienza di trasduzione variabile. • Poco efficace se purificato bene. Herpes Simplex Virus (HSV) (ds DNA 152Kb, >70 genes) genome Latency transcripts Latency promoter Herpes Simplex Virus (HSV) • Genoma di DNA doppio filamento molto grande (152 kb) e complesso (>70 geni). • Spiccato neurotropismo. • Nelle cellule infettate è in forma episomica in uno stato latente. • Possibile inserire geni molto grandi. • Forti reazioni immunologiche. • Presenza di anticorpi contro il virus in un’elevata percentuale di casi. Potenzialità di combinazione tra terapia genica e purificazione cellule staminali Perché qualcuno sta pensando seriamente alla clonazione umana? • Il problema principale della terapia cellulare è l’istocompatibilità>rigetto • La clonazione permetterebbe di ottenere cellule staminali totipotenti dotate delle stesse caratteristiche antigeniche del paziente, da usare per il trapianto dopo la correzione del difetto. Perché qualcuno sta pensando seriamente alla clonazione umana? Cellula somatica normale Cellule somatiche paziente Cellule totipotenti sane istocompatibili Ovocita Terapia genica del cancro: potenziamento della risposta immune Terapia genica del cancro: sensibilizzazione cellule tumorali a farmaci TK Vectors for gene therapy according to www.wiley.co.uk/genetherapy (june 1999) Adeno Lipo Retro retrovirus liposome adenovirus retro prd cl vaccinia naked DNA others