Terapia genica
-malattie infettive
-tumori
-malattie ereditarie
-malattie del sistema immunitario
Terapia genica classica:
A)Produrre la sostanza che manca al paziente
B)Eliminare direttamente le cellule malate
C)Attivare le cellule del sistema immunitario favorendo così l’uccisione delle
cellule malate
Terapia genica non convenzionale: inibire l’espressione dei geni coinvolti
nella patogenesi, o di correggere un difetto genetico e quindi restaurare
la normale espressione genica.
Non e` utilizzabile nella
Sperimentazione Clinica
TERAPIA GENICA
Tecnica terapeutica in cui un gene funzionale viene inserito nelle cellule
somatiche di un paziente
Scopo:
• Correggere un difetto genetico
• Fornire una nuova funzione alla cellula
Applicabilità:
1. Malattie genetiche classiche
(un solo gene coinvolto, ereditarietà mendeliana)
2. Malattie multigeniche (cancro)
3. Malattie genetiche acquisite (AIDS)
4. Malattie non genetiche
80% dei protocolli coinvolge malattie delle categorie 2-4
Terapia genica in vivo ed ex vivo
Terapia genica EX VIVO
Trapianto di cellule geneticamente
modificate:
• Estrazione/preparazione delle
cellule primarie o di linea
• Trasferimento del gene in vitro
• Reimpianto delle cellule
Problemi:
• Cellule autologhe ingegnerizzate:
laboriosa, vita limitata
• Cellule eterologhe ingegnerizzate:
reperibilità, compatibilità
TERAPIA GENICA IN VIVO
Somministrazione diretta del gene terapeutico
in vivo alle cellule:
• iniezione diretta (ad es. nel muscolo scheletrico distrofico)
• somministrazione in prossimità del tessuto
(ad es. vie respiratorie nella fibrosi cistica)
Problemi:
• Trasferimento quantitativamente limitato
• Rischio di inserimento in cellule sane
• Reazione immunitaria
Geni integrati nei cromosomi (retrovirus)
Geni non integrati (necessità di trattamenti ripetuti) (adenovirus)
VETTORI VIRALI
Vettore virale
Vantaggi
Svantaggi
Retrovirus
Capacità d'inserimento del gene, integrazione stabile
Difficoltà nel controllare l'infezione virale,
nel DNA dell'ospite, elevati titoli di virus
mancata infezione delle cellule non in divisione,
ricombinante, ampio tropismo d'infettività, relativa
integrazione a caso nel genoma dell'ospite
facilità di manipolazione del genoma virale
Lentivirus
Infezione delle cellule in divisione o meno, espressione
stabile del gene, elevata capacità d'inserimento
Adenovirus
Elevati titoli di virus, alta espressione genica, grande
Risposte immuni alle proteine virali, nessuna
capacità d'inserimento, infezione di cellule in divisione integrazione nel genoma dell'ospite, espressione
e non in divisione
genica transitoria
Virus adeno-associati
Infettano le cellule in divisione o meno, ampio
tropismo cellulare, potenziale d'integrazione, bassa
immunogenicità e non patogenicità
Mutagenesi potenziale presenza di sequenze
proteiche regolatrici e accessorie
Limitate capacità per i transgeni, difficile
generazione di alti titoli virali, presenza di
adenoviruds o herpevirus per la moltiplicazione
dei virus adeno-associati
Herpesvirus
Infettano un'ampia varietà di tipi cellulari, alta capacità
Possibile tossicità, rischio di ricombinazione,
d'inserzione, tropismo naturale per le cellule neuronali, nessuna integrazione virale nel DNA dell'ospite
seguita dalla produzione di alti titoli virali
Poxvirus
Alta capacità d'inserzione, possibile inserzione di grandi
framenti di DNA, alti livelli di di espressione
transgenica,, seguita da virus vivo ricombinante
Virus di Epstein-Barr
Infetta cellule in divisione o meno con prevalenza per i Difficoltà di controllare le linee cellulari
linfociti B, alta capacità d'inserimento
Possibile effetto citopatico
Vantaggi dei vettori non virali
•
•
•
•
Impossibile la generazione di nuovi virus patogeni
Riduzione del rischio di reazione immunitaria
Possono trasferire molti tipi diversi di molecole, e permettono di trasdurre
molecole di DNA anche molto grandi
Possibilità di produzione in grandi quantità a basso costo
Svantaggi dei vettori non virali
•
•
Scarsa efficienza sia di trasduzione che di integrazione
Se integrati possono a loro volta dare mutagenesi inserzionale
Vantaggi dei vettori virali
•
Alta efficienza di trasduzione
Svantaggi dei vettori virali
•
Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus
presenti nell’ospite
Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel
genoma)
Molecole di DNA di dimensioni limitate
Reazioni immunitarie
Costi elevati
•
•
•
•
Gli adenovirus penetrano nelle cellule con un meccanismo di endocitosi mediata
dai recettori
Recapito di geni mediato dai liposomi in vivo
Il trasferimento genico che utilizza
l’endocitosi mediata da recettori
Inibizione mirata dell’espressione genica in vivo
PROBLEMI DELLA TERAPIA GENICA
1.Stabilità d’espressione del transgene nel tempo
2. Mutagenesi inserzionale
3. Regolazione dell’espressione del transgene
(promotori inducibili)
4. Cell targeting
5. Pericolosità, Etica
TERAPIA GENICA NELLE MALATTIE GENETICHE
CLASSICHE
E’ importante stabilire se il processo citopatico risulta da:
Loss of function del gene mutato, cioè la mutazione nel
gene provoca perdita della funzione genica
introduzione del gene normale OK
Gain of function cioè la mutazione nel gene produce una
proteina con funzioni diverse da quelle della proteina
normale introduzione del gene normale INEFFICACE
Caratteristiche del vettore ideale per la TERAPIA GENICA
• Efficiente (trasdurre un numero di cellule elevato).
• Dovrebbe garantire una prolungata produzione della proteina
terapeutica (a livelli adeguati).
• Capace di incorporare DNA di varie dimensioni.
• Dovrebbe garantire la regolazione (trascrizionale, traduzionale o
post-traduzionale) dell’espressione del gene terapeutico
• Non dovrebbe essere patogeno.
• Amministrabile direttamente nel paziente.
• In grado di raggiungere specificamente le cellule bersaglio.
• Ben tollerato.
• Non dovrebbe avere componenti che inducono risposta immune.
• Facile da produrre in maniera riproducibile.
IL VETTORE IDEALE NON ESISTE. IL VETTORE PIU’
UTILIZZATO OGGI E’ IL VETTORE RETROVIRALE
Vettori Retrovirali:
• Pro situazione attuale e prospettive future
– efficiente trasduzione di cellule in attiva replicazione
• linfociti e precursori delle linee ematopoietiche
– notevole esperienza clinica ex vivo
(linee tumorali)
• Contro
– integrazione random
• attivazione di oncogeni
• shut-off trascrizionale dipendente dal sito di integrazione
– capacità di impaccamento limitate (max. 7 kb)
- Incapacità di infettare cellule in quiescenza (cellule nervose)
TERAPIA GENICA per deficit dell’ADA
ADA (adenosina deaminasi): enzima coinvolto nel salvataggio delle purine nel percorso di
degradazione degli acidi nucleici, indispensabile in molti tipi cellulari.
La sua carenza causa una patologia recessiva molto rara che ha effetti molto seri sui linfociti
T, una delle principali classi di cellule del sistema immunitario: GRAVE E COMPLESSA
IMMUNODEFICIENZA
ADA e TERAPIA GENICA:
1)Il gene ADA è piccolo e clonato nel 1990
2)Le cellule bersaglio sono i Linfociti T, cellule facilmente ottenibili dal paziente e facilmente
coltivabili TERAPIA GENICA EX-VIVO
3)Livello di espressione puo’ variare senza conseguenze (range 10-5000&)
Struttura genomica ed
espressione genica dei retrovirus
•
Il genoma tipico contiene 3
“geni”
– Gag (componenti del core
nucleoproteico)
– Pol (replicazione e
ricombinazione)
– Env (componente della
membrana esterna)
Genoma retrovirale
Trascrittasi inversa e integrasi
Proteina strutturale capside
Proteina per involucro
Psi + non codificante. Per confezionamento nel capside
Lunga sequenza terminale ripetuta
Vettore retrovirale
Lunghezza massima: 8Kb
Inserito nelle
cellule eucariotiche
con bassissima efficienza
tramite
trasfezione/elettroporazione
Con alta efficienza
Mediante
INFEZIONE
Packaging cell lines
Linee cellulari transfettate stabilmente con geni virali
codificanti per proteine strutturali del capside (late
genes), necessarie per l’assemblaggio dei virioni.
La loro transfezione transiente con il DNA-vettore
determina l’impacchettamento del costrutto nel
virione.
Si ottiene in questo modo un vettore virale di
transfezione completo.
Dr. Sara Caldarola
Dr. Sara Caldarola
Dr. Sara Caldarola
Terapia con incremento delle copie geniche ex vivo per la deficienza
di adenosina deaminasi (ADA) 1990
La modificazione genetica dei linfociti che infiltrano il tumore coltivati in vitro
Può essere utilizzata per far esprimere geni “terapeutici” in un tumore solido
Terapia genica in vivo per i tumori cerebrali