L’ingegneria genetica applicata alla
generazione di piante ed animali transgenici
Organismi Transgenici
Si dice Transgenico un organismo nel quale sia stata introdotta una sequenza di
DNA aggiuntiva (transgene) rispetto a quelle derivate dal patrimonio genetico
dei progenitori.
Tale DNA potrà essere integrato nel genoma dell’organismo stesso oppure, in
casi particolari, replicare autonomamente all’interno delle cellule (episoma).
Tale gene potrà essere presente nel genoma di tutte le cellule dell’organismo,
comprese le cellule riproduttive, e trasmettersi perciò spontaneamente alle
generazioni successive. Potrà al contrario essere presente soltanto nelle cellule di
alcuni tessuti dell’organismo senza interessare le cellule riproduttive e senza
perciò essere trasmesso alla discendenza (transgenesi somatica).
Nell’accezione più comune del termine si definiscono però transgenici solo gli
organismi nei quali il transgene sia integrato nel genoma e trasmissibile alla
progenie.
Università Cattolica del Sacro Cuore
Centro Ricerche Biotecnologiche
Aspetti tecnici relativi alla transgenesi nei vegetali
Positivi:
Possibilità di riprodurre interi organismi partendo da cellule somatiche
(clonazione)
Rapidità di sviluppo e di ottenimento di un elevato numero di individui
discendenti
Possibilità di autoimpollinazione (selfing) in alcune specie
Negativi:
Poliploidia, cioè presenza di copie multiple del corredo cromosomale, in
numerose varietà vegetali (essenze erbacee, patate). Da ciò derivano gli
effetti di variazione somaclonale. (individui derivanti da cellule di un unico
progenitore manifestano caratteri differenti)
Struttura cellulare dotata di parete rigida (cellulosa) che rende
tecnicamente complessa l’introduzione di macromolecole
Sviluppo clonale e coltura in vitro di cellule vegetali: Colture
da Dischi Fogliari (Leaf Disk)
✔ Le cellule somatiche vegetali,
almeno in parte, mantengono una
elevata potenzialità di sviluppo e
differenziamento;
✔ Questa potenzialità si manifesta in
natura nel processo di riparazione
di una lesione con la formazione
del callo
✔ Le cellule del callo presentano una
spiccata tendenza alla
proliferazione ma in certe
condizioni possono dare luogo alla
formazione di radici e foglie fino a
generare un nuovo individuo
Formazione di Protoplasti
Lo sviluppo ed il
differenziamento
delle cellule vegetali
è regolato dai
segnali chimici
portati da fitormoni.
I fitormoni vengono
divisi in auxine e
citochine in base ai
loro effetti.
Un elevato rapporto
tra auxine e
citochine provoca lo
sviluppo di radici
mentre il rapporto
inverso favorisce la
formazione di
germogli.
Tecniche di Transgenesi nei Vegetali.
Utilizzo di Agrobacterium spp. Come vettore
Vettori virali per la replicazione somatica
Transfezione di Protoplasti
“GeneGun “
L’applicabilità delle diverse tecnologie varia secondo la specie in esame.
In generale risulta più semplice operare con piante dicotiledoni (ad. es.: le
Leguminose) che con le monocotiledoni ( quali i cereali).
Per le prime si possono utilizzare tutte le tecniche riportate, mentre per le
monocotiledoni solo l’utilizzo di protoplasti e la tecnica che impiega il
“GeneGun” hanno fornito risultati accettabili.
Biologia di Agrobacterium tumefaciens
Utilizzo di Agrobacterium per la generazione di Piante
transgeniche: Cointegrazione
Agrobacterium nella generazione di Piante transgeniche
Utilizzo di Agrobacterium
per la generazione di
Piante transgeniche:
Sistema Binario
Trasferimento genico in
vegetali adulti mediante
vettori di derivazione virale
•E’ possibile sfruttare le proprietà
naturali di alcuni virus dei vegetali
per consentire il trasferimento di
geni in individui adulti
•Tali sistemi permettono la
diffusione del transgene a diverse
cellule dell’organismo vegetale ed
eventualmente alla discendenza
•La modificazione del vettore
virale ne impedisce la diffusione
nell’ambiente e l’effetto
fitopatogeno.
Trasferimento genico in vegetali mediante sistemi fisici.
Trasferimento in protoplasti e ricostituzione di colture da
callo
•Mentre i vettori basati sull’Agrobacterium sono efficaci nelle
dicotiledoni, essi non risultano efficaci nei monotiledoni.
•In questo settore un certo successo è stato ottenuto trasformando colture
di protoplasti mediante il contatto con una soluzione del DNA di
interesse e successiva esposizione ad uno shock elettrico
(Elettroporazione)
•I protoplasti così trattati sono poi coltivati in terreno selettivo per
ricostituire nuove piantine transgeniche.
•Il metodo offre discreti accettabili in specie quali il Mais ed ilRiso ma è
stato soppiantato da sistemi più semplici ed efficaci quali l’impiego del
“GeneGun”
Applicazioni del trasferimento genico in campo agricolo.
Organismi autorizzati negli USA.
C a r a tte r e
G e n e tic o
O r g a n is m o R ic e v e n te
O r g a n is m o
D o n a to r e
R e s is te n z a
a g li In s e tti
(B T )
M a is , c o to n e , p a ta ta ,
p o m o d o ro
B a c illu s
th u rig e n s is
R e s is te n z a
a g li e rb ic id i
M a is , s o ia , c o to n e , ris o ,
b a rb a b ie to la d a
z u c c h e ro , lin o , c a n o la
G e n i a d a tta ti d a
ta b a c c o o d a
b a tte ri
R e s is te n z a a
V iru s
Z u c c h in i, p a p a y a , p a ta ta
V iru s v e g e ta li
R a m m o llim e n
to ra lle n ta to
P o m o d o ro
P o m o d o ro ,
b a tte ri, v iru s
C o n te n u to d i
a c id i g ra s s i
m o d ific a to
C o n tro llo d e i
p o llin i
S o ia , c a n o la
S o ia o a ltri
v e g e ta li
R a d ic c h io , m a is
B a tte ri d e l
s u o lo
I Dubbi circa la sicurezza per il consumatore e per
l’ambiente.
✔ Aspetti di salubrità per il consumatore
✔ E’ possibile che i cibi transgenici risultino tossici?
✔ E’ possibile che i cibi transgenici provochino allergie?
✔ E’ possibile che l’ingestione di cibi transgenici portatori di geni per la resistenza agli antibiotici
possa diffondere questa caratteristica a microrganismi patogeni?
✔ Aspetti ambientali
✔ L’uso di vegetali resistenti agli erbicidi ne ridurra o ne aumenterà l’utilizzo?
✔ Questi organismi potranno diffondere le proprie caratteristiche di resistenza alle piante infestanti
selvatiche?
✔ Potrebbero essere essi stessi delle piante infestanti?
✔ L’uso ripetuto degli stessi diserbanti potrebber indurre l’insorgenza di piante infestanti ad essi
resistenti?
✔ L’utilizzo di Vegetali transgenici ad attività insetticida potrebbe determinare la scomparsa di
popolazioni di insetti non nocivi e squilibri dell’ecosistema?
Tecniche di Introduzione di Transgeni in Organismi
Animali
Integrazione “Random”
✔ Microiniezione pronucleare
Applicabile a molte specie
necessita di zigoti
Integrazione casuale del transgene
✔ Vettori Retrovirali
L’integrazione avviene nelle cellule in divisione (generazione di “mosaici”)
Sito di integrazione non prevedibile anche se non del tutto casuale
✔ Vettori Lentivirali
Integrazione efficiente anche in cellule non in divisione
✔ Elettroporazione, vettori liposomali
Integrazione casuale
alta percentuale di ricombinazione e di inattivazione dei transgeni
✔ Sperm-Mediated DNA transport
Dopo la prima pubblicazione sono mancate le conferme sperimentali da parte di altri gruppi
Sviluppo embrionale
Regolazione dell’espressione
Ruolo del promotore
Microiniezione Pronucleare
Procedura di microiniezione nel topo
Procedura di microiniezione nel topo (2)
Microiniezione nel Bovino
Esempio di efficienza della tecnica di transgenesi per
microiniezione nel bovino
Oociti recuperati
2470
Oociti maturati
2297
Oociti fertilizzati
1358
Zigoti microiniettati
1154
Zigoti sopravvissuti
981
Embrioni sviluppati in vitro
687
Embrioni trasferiti
(100%) 129
Vitelli nati
Vitelli transgenici
da Krimpenfort, 1991
(100%)
21
(1.5%)
2
(0,08%)
PUNTI CRITICI
Efficienza e costi
Regolazione e livello di espressione
Previsione degli effetti collaterali
Ciclo biologico dei retrovirus
Vettori Retrovirali
Tecniche di Introduzione di Transgeni in Organismi
Animali
Integrazione Mirata
✔ Ricombinazione omologa in E.S.Cells e derivazione di animali
chimerici
Integrazione mirata del transgene
Applicabile soltanto al Topo
✔ Nuclear transfer da cellule geneticamente modificate
E’ la tecnica più recente ed appare come la più promettente.
Introduzione mirata del transgene. Elevata efficienza. Applicabile a diverse specie di animali domestici
Ricombinazione omologa
La ricombinazione omologa
Gene bersaglio scelto opportunamente oppure inserzione in “siti neutrali”
Iniezione in Blastocisti
Gene Targeting 1
Gene Targeting 2
Le cellule staminali embrionali
Limite nelle specie zootecniche:
Molto difficili da isolare
Chimerismo e lunghi intervalli di generazione
Nuclear transfer da cellule embrionali
Nuclear Transfer da cellule differenziate
Enucleazione e Nuclear Transfer nel topo
Enucleazione e Nuclear Transfer
Il trapianto nucleare nella pecora : Dolly
Il trapianto nucleare
Animali clonati: Dolly, Galileo
Animali clonati da cellule trasfettate: pecora che esprime il fattore IX umano
Animali clonati da cellule trasformate per ricombinazione omologa: ovino e suino. Sono stati clonati bovini da fibroblasti ottenuti da biopsia e coltivati in vitro per lunghi periodi (30 divisioni)