Adriana Maggi
METODOLOGIE DI IMAGING PER LO STUDIO DI
EVENTI MOLECOLARI IN ORGANISMI VIVENTI
GENERAZIONE DI ANIMALI REPORTER
Ingegneria Animale
animali mutati geneticamente ad esprimere un gene
reporter
METODI DI INGEGNERIA
ANIMALE
Iniezione di DNA esogeno nella cellula
uovo (TRANSGENESI STANDARD)
Ingegneria di cellule staminali in coltura
e loro iniezione in blastocisti (GENE
TARGETING)
TRANSGENESI
STANDARD
Microiniezione
del DNA clonato
zigote
Embrione
stadio 2 cellule
Impianto nella
femmina
pseudogravida
10-20% dei nascituri
contiene il transgene
GENE TARGETING
Trasfezione
del DNA clonato
in cellule ES
Iniezione delle
cellule staminali
nella blastocisti
Impianto della
blastocisti in femmina
pseudogravida
Topo chimerico
Ibrido F1
25-75% della progenie
portano il transgene
Preparazione
oociti fecondati
Preparazione
‘pseudo pregnant’
microiniezione
Preparazione
costrutti
Screening della
progenie
Preparazione oociti fecondati
Cocktail
ormonale
Incrocio
Recupero uova
fecondate
Preparazione del costrutto
Purificazione del transgene
propagazione del transgene
transgene
Vettore di clonaggio
Preparazione delle
‘pseudo pregnant’
Femmina
Maschio
vasectomizzato
Incrocio
Impianto degli oociti microiniettati
Microiniezione e reimpianto
degli oociti microiniettati
Prelievo delle uova
fecondate
Microiniezione
Trasferimento delle uova fecondate
microiniettate con il gene di
interesse nell’utero di femmina
pseudogravida
Screening della progenie
Analisi del DNA
estratto dalle code
della progenie per :
PCR
Southern blot
GENE TARGETING - procedura • generazione di cellule staminali (Embryonic Stem
cells o cellule ES)
• preparazione del vettore
• trasfezione delle cellule ES con il vettore
• iniezione delle cellule trasfettate nella blastocisti
• generazione di topi mosaico
• incroci successivi per ottenere l’animale con il
transgene nella linea germinale
Generazione di cellule staminali ES
Blastocisti
Femmine dopo 3-4 giorni
dal concepimento
Espianto e messa in
coltura
Crescita in terreno
selettivo per le ES
Disaggregazione
1 passaggio
Linea pura
Trasfezione delle ES
Trasfezione del vettore (elettroporazione)
Selezione delle
cellule knock out
Cellule ES
Strategia di selezione delle ES knock out
Destino del DNA
Integrazione sito
specifica
Integrazione random
Frequenza: Omologa/non omologa = 1/1000
Iniezione delle cellule ES nella blastocisti
- generazione di animali mosaico -
Incroci per l’omozigosi
Founder/wild type
F1/F1
F2
Omozigoti 1:4
Eterozigoti 1:2
Wild type 1:4
REPORTER SYSTEMS
TO STUDY DRUGS ACTIVE
THROUGH INTRACELLULAR
RECEPTORS
ER
ER
POL II, TF,
co-regulators
ER ER
ERE
transcription
Reporter
GFP
Reporter: easily
detectable protein
REPORTER MOUSE
The ERE-Luc reporter mouse: a model
to study of ER transcriptional activity
+/-
+/ERE 2x
INSULATOR
( MAR )
kinase-dependent
activation
TK
INSULATOR
firefly luciferase
luciferin + ATP = oxyluciferin + AMP +
( MAR )
light
ERE-Luc reporter mouse
Ciana et al., 2001
Evaluation of ER transcriptional activity
20
min.
i.p. of D-luciferin
5 min. after the
acquisition
ERE-Luc mouse
13.5
14.5
15.5
16.5
dpc (day post conception)
18.5
ER is transcriptionally active at day 14.5
pc
ERE-Luc mouse
13.5
14.5
12.5
dpc (day post conception)
imaging
IHC
A
B
16.5
endoderm
C
18.5
P1
post-natal
day 1
ectoderm
mesoderm
D
F
G
E
H
16.5 dpc
16.5 dpc
GP Rando, 2007
C – intestine
D – bone
E – heart
F – forebrain
G – moustache
H – skin
20x
40x
40x
10x
40x
20x
ERE-Luc mouse
4
ovaries
6
bone
4
2
LUCIFERASE ACTIVITY (RLU)
2
Luciferase activity in adult, cycling females
0
(pg/ml)
Estradiol
E2 (pg/ml)
M
50
5
040
4
30
30
020
2
0
10
10
D
day
M 1
day
D 2
P
day3
P
E
day
E 4
9
7
5
3
1
12
uterus
0
20
brain
15
10
5
hypothalamus
0
4
6
3
2
0
20
1
0
16
liver
10
thymus
intestine
12
8
4
0
Ciana et al, Nature Ned., 2003
0
P
E
D2
M D
P
E
M D
D2
ERE-Luc mice to understand ER involvement
in mammals physiopathology
Pregnancy
&
Embryo
Development
Suckling
Mice
19.5
DAY 1
18.5
DAY 10
DAY 18.5
17.5
DAY 16.5
16.5
CYCLE
DAY 15.5
15.5
14.5
LIFE
DAY 14.5
13.5
Immature
Mice
DAY 13.5
12.5
Adult Mice
MOLECULAR IMAGING IN LIVING SMALL ANIMALS
Functional Magnetic Nuclear Resonance
Nuclear imaging
MicroPET
Positron emission tomography
Micro SPECT
single-photon emission
computerized tomography
Optical imaging
Bioluminescence
Fluorescence
Ultrasound
2/06
ONE PICTURE IS WORTH TEN THOUSAND WORDS
(Frederic Barnhard 1927)
PARTICULARLY,
IN PHARMACOLOGICAL RESEARCH!
2/06