CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL
FARMACO
Adriana Maggi
BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE
2010-11
LEZIONE 14
The ERE-Luc reporter mouse: a model
to study of ER transcriptional activity
+/-
+/INSULATOR
( MAR )
kinase-dependent
activation
ERE 2x
TK
INSULATOR
firefly luciferase
luciferin + ATP = oxyluciferin + AMP +
( MAR )
light
ERE-Luc reporter mouse Ciana et al., 2001
4
ERE-Luc mouse
ovaries
6
bone
4
2
2
(pg/ml)
Estradiol
E2 (pg/ml)
M
50
5
040
4
30
30
020
2
0
10
10
D
day
M 1
P
day
D 2
day3
P
E
day
E 4
LUCIFERASE ACTIVITY (RLU)
Luciferase activity in adult, cycling females
0
9
7
5
3
1
12
uterus
0
20
brain
15
10
5
hypothalamus
0
4
6
3
2
0
20
1
0
16
liver
10
thymus
intestine
12
8
4
0
Ciana et al, Nature Ned., 2003
0
P
E
D2
M D
P
E
M D
D2
THE COMPLEXITY OF
ESTROGEN ACTION
THE COMPLEXITY OF
ESTROGEN TARGETS
• REPRODUCTIVE SYSTEM
- male and female gonads
- hypothalamus and pituitary
G-protein,
IP3K...
SP1
NFKB
AP1
• SKELETAL SYSTEM
• VASCULAR SYSTEM
- endothelium
- smooth muscle cells
• RESPIRATORY SYSTEM
• IMMUNE SYSTEM
• NERVOUS SYSTEM
- central
- peripheral
ER COMPLEXITY OF ACTION
and A NEW CLASS OF
DRUGS: Selective Estrogen
Recepor Modulators
CNS
cardiovascular
growth
factors
reproductive
P
bone
SP1
NFKB
AP1
tissue-specific
coregulators
ESTROGEN REPLACEMENT THERAPY
The efficacy of SERMs on estrogen receptor
transcriptional activity was measured in a model
of surgical menopause (ovx mice)
SERMs ability to replace the natural hormone was
evaluated by comparison with ER activity in
healthy, cycling mice
Measuring bioluminscence
in the ERE-Luc reporter mouse
Hepatic area
Reproductive organs
(mammari glands and
vagina)
Intestine
Muscle-Skeletal System
Thymic area
Bioluminescence after
6h treatment with
15b-estradiol (50ug/kg)
pellet
days of treatment
CONTROLS
In vivo analysis of photon emission
Manual
Automatic
REFERENCE DRUG
DRUG OF INTEREST
Rando et al. 2009
REPORTER MICE TO STUDY DRUG ACTION “IN VIVO”
Photon emission
1000000
500000
0
8000000
AUC
20
VAGINA
RLU
1500000
Luciferase enzymatic activity
UTERUS
15
10
5
0
CHEST
500
6000000
4000000
2000000
LIVER
300
200
100
0
0
CHEST
2
Photon emission
Photon
p/s/cm /sr
emission
p/s/cm2/sr
100000
70000
40000
0
VAGINA
400000
300000
200000
100000
10000
Biserni et al, in preparation
Vehicle
PCUD 3mg/kg
BZA 10mg/kg
BZA 10mg/kg + PCUD 3mg/kg
Raloxifene 10mg/kg
400
RLU
AUC
2000000
1
0
2
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Days
Days
Effects of SERMs on ER activity – in vivo imaging
CHRONIC treatment (21 days)
2000000
100000
**
°
1500000
70000
AUC
Photon emission
p/s/cm2/sr
REPRODUCTIVE AREA
40000
1000000
500000
10000
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
0
Days
Biserni et al, in preparation
Vehicle
PCUD 3mg/kg
BZA 10mg/kg
BZA 10mg/kg + PCUD 3mg/kg
Raloxifene 10mg/kg
Effects of SERMs on ER activity – in vivo imaging
CHRONIC treatment (21 days)
100000
2000000
80000
1500000
AUC
Photon emission
p/s/cm2/sr
LIMBS
60000
1000000
40000
500000
20000
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Days
Vehicle
PCUD 3mg/kg
BZA 10mg/kg
BZA 10mg/kg + PCUD 3mg/kg
Raloxifene 10mg/kg
100000
2000000
80000
1500000
AUC
Photon emission
p/s/cm2/sr
TAIL
60000
40000
1000000
500000
20000
0
1
2
3
4
5
6
Biserni et al, in preparation
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Days
0
ovx
cyc
E2
CE
Rando et al, Mol. Endocrinol. 2010
CE+BZA BZA
150
0
0
RAL2
RAL10
LAS
OSP
LA
S
TA
M
A
L2
R
ZA
0
LA
S
A
L1
SP
O
A
L2
R
50
ZA
100
B
100
R
300
SP
250
O
200
0
B
TAIL
E2
limb
PC
U
D
P+
B
ZA
50
E2
100
cy
c
150
ov
x
200
cts/cm2 s (vs cyc=100%)
limb
PC
U
P+ D
B
Z
R A
A
L1
0
200
AUC
250
ov
x
cy
c
TA
M
R
A
L2
LA
S
SP
O
400
E2
PC
U
D
B
ZA
LA
S
O
S
P+ P
B
ZA
R
A
L2
R
A
L1
0
cy
c
0
E2
ZA
A
L1
0
PC
U
D
B
ZA
CHRONIC
R
500
ov
x
cts/cm2 s (vs cyc=100%)
ACUTE
B
P+
ov
x
cy
c
AUC
LIMB
tail
600
500
400
300
200
150
100
50
tail
TAM
HEPATIC
AREA
hepatic
ovx
50
CE
CE+BZA BZA
Rando et al, Mol. Endocrinol. 2010
RAL2
ZA
PC
U
D
P+
B
ZA
R
A
L1
0
R
A
L2
B
E2
LA
S
SP
RAL10
LAS
B
ZA
R
A
L2
O
SP
LA
S
R
O
PC
U
E2
E2
0
ov
x
cy
c
0
SP
A
L1
P+ 0
B
ZA
R
A
L2
TA
M
B
ZA
LA
S
50
E2
100
D
100
PC
U
P+ D
B
Z
R A
A
L1
0
TA
M
AUC
150
200
cyc
abdomen
0
250
E2
PC
U
D
O
SP
R
A
L1
0
B
ZA
LA
S
P+
B
ZA
R
A
L2
cy
c
100
200
300
ov
x
cy
c
AUC
hepatic
0
150
O
100
200
cy
c
200
250
ov
x
300
3500
2500
1500
500
CHRONIC
cts/cm2 s (vs cyc=100%)
2000
1500
1000
500
400
ov
x
cts/cm2 s (vs cyc=100%)
ACUTE
ABDOMEN
abdomen
OSP
TAM
SERCHING FOR NOVEL MODALITIES TO MEASURE
THE EFFICACY OF SERMs
N° peaks, amplitude, frequency
Photon emission
p/s/cm2/sr
400000
CHEST
300000
200000
AUC
100000
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Days
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
GENITAL AREA
C
8
6
6
4
4
2
2
0
0
12
12
Peaks/21d
Amplitude
B
8
9
6
Period (d)
A
*
**
*
6
3
0
0
6
6
5
5
4
4
3
3
2
2
AUC
200
*
*
200
*
150
50
0
200
600
450
300
200
150
100
50
0
100
* **
100
0
Potency
E
*
250
100
150
* * * **
9
3
800
600
400
300
D
SKELETAL AREA
*
**
50
0
*
*
*
Rando et al, Mol. Endocrinol. 2010
ovx
cyc
E2
CE
CE+BZA BZA
RAL2
RAL10
LAS
OSP
TAM
PHENETICS OF DRUG ACTION
THE APPLICATION OF AGGLOMERATIVE HIERARCHICAL CLUSTERING
(AGGLOMERATIVE NESTING version 1.02 )
period
DEGREE OF FUNCTIONAL CORRELATION AMONG THE PARAMETERS SELECTED
a
8
b
period
0.04
amplitude
0.05
<0.01
AUC
0.03
0.05
0.96
potency
0.10
0.05
0.76
0.46
period amplitude
AUC
6
4
amplitude
2
1000
peaks
number
100
10
1
0.1
10000
AUC
**
p<0.01
1000
100
10
100
**
potency
**
p<0.01
p<0.01
10
1
0
2
4
6
peak number
Rando et al, Mol. Endocrinol. 2010
8 2
4
6
period
8 0.1
1
10
amplitude
100 10
100 1000 10000
AUC
Space-temporal analysis of drug action in
living animals
clustering data to generate novel families of
compounds
Genital area
Skeletal area
Rando et al, Mol. Endocrinol. 2010
ovx
cyc
E2
CE
CE+BZA BZA
RAL2
RAL10
LAS
OSP
TAM
A
Genital area
B
Skeletal area
C Reverse Medicinal Chemistry
Cl
ovx
cyc
E2
CE
CE+BZA BZA
Rando et al, Mol. Endocrinol. 2010
RAL2
RAL10
LAS
OSP
TAM
…IL MEDICO ADOPRERA’ BENE
LE MEDICINE QUANDO LUI CONOSCERA’
CHE COSA E’ OMO,
CHE COSA E’ VITA E COMPLESSIONE,
CHE COSA E’ SANITA’…
ERE-Luc mouse
13.5
14.5
12.5
dpc (day post conception)
imaging
A
IHC
B
16.5
endoderm
C
18.5
P1
post-natal
day 1
ectoderm
mesoderm
D
F
G
E
H
16.5 dpc
GP Rando, 2007
16.5 dpc
C – intestine 20x
D – bone
40x
E – heart
40x
F – forebrain 10x
G – moustache 40x
H – skin
20x
ERE-Luc mouse
13.5
14.5
15.5
16.5
18.5
dpc (day post conception)
ER is transcriptionally active at day 14.5 pc
ERE-Luc mice to understand ER involvement in mammals
physiopathology
Pregnancy
&
Embryo
Development
Suckling
Mice
19.5
DAY 1
18.5
DAY 10
DAY 18.5
17.5
DAY 16.5
16.5
CYCLE
DAY 15.5
15.5
14.5
LIFE
DAY 14.5
13.5
Immature
Mice
DAY 13.5
12.5
Adult Mice
The real impact of molecular
engineering on drug discovery
“The whole is more
than the sum of its
parts “
Aristotle (384 BC – 322 BC)
Methapysics
MODERN PHARMACOLOGY
NEEDS TO REVISIT ANIMAL
MODELS
FARMACI BIOTECNOLOGICI
PROTEINE TERAPEUTICHE
DI PRIMA E SECONDA GENERAZIONE
ACIDI NUCLEICI per la regolazione della espressione di
specifici geni
VANTAGGI NELL’UTILIZZO DI FARMACI
ANTI-ACIDI NUCLEICI
BERSAGLIO MOLECOLARE PIU’ DEFINITO
Numero di proteine intracellulari: 1000-100000
Numero di RNA: 100-10000
Numero di geni: 1-2
AZIONE MOLTO SPECIFICA
Bersagli possono essere sequenze anche uniche nel genoma
Utilizzando interazioni con altri nucleotidi si possono sfruttare i
vantaggi della complementarità tra due catene secondo il
modello di Watson e Crick
ESPRESSIONE GENICA IN EUCARIOTE: SEQUENZA DI EVENTI
3’ TRASCRIZIONE
RNA, trascritto primario
MODIFICAZ.
TP
Capping e poliadenilazione
Splicing o maturazione
Fuoriuscita dal nucleo
riconoscimento da parte dei ribosomi
traduzione
TRADUZIONE
Modificazioni post-traduzionali
La rilevanza dei processi di regolazione
della espressione genica
nel disegno di nuovi farmaci
L’omeostasi cellulare è mantenuta da un efficiente
controllo della trascrizione genica che viene
assicurato da un complesso circuito molecolare che
utilizza fattori di trascrizione individali, l’apparato
basale di trascrizione e i complessi multiproteici
coregolatori della trascrizione.
La cromatina ha un ruolo
fondamentale nella reglazione
della espressione genica e la
capacità degli istoni di legare il
DNA è regolata da enzimi
intranucleari che possono
apportare modificazioni posttraduzionali soprattutto ai
residui di lisina e arginina posti
nel dominio N-terminale delle
proteine istoniche
Modificazioni degli istoni: acetilazione, fosforilazione, metilazione,
ubiquitinazione
MODIFICAZIONI POST-TRADUZIONALI DEGLI ISTONI
Zhang Y , Reinberg D Genes Dev. 2001;15:2343-2360
Metilazione degli istoni
La metilazione degli istoni aumenta lo stato di
idrofobicità e la basicità delle porzioni N terminali degli
istoni: questo ne aumenta l’affinità per proteine
specifiche e fattori di trascrizione.
Le metilasi necessitano di cofattori: es. la sadenosilmetionina
Generalmente la metilazione degli istoni si associa a repressione
della espressione genica, tuttavia ci sono esempi in cui la
metilazione si associa a attivazione della espressione genica
(metilazione lella lisina 4 dell’istone 3, il coattivatore CARM1 è una
metiltransferasi)
PROCESSI DI ACETILAZIONE E
DEACETILAZIONE SONO IMPORTANTI
NELLA REGOLAZIONE DELLA ATTIVITA’
DELLA CROMATINA
ESPRESSIONE GENICA E’ GENERALMENTE
ASSOCIATA CON ACETILAZIONE