Ibridazione degli acidi nucleici e
misurazione dell’espressione di un gene
Condizioni che possono destabilizzare la
doppia elica provocando la separazione delle
due catene (denaturazione)
1.
2.
3.
4.
Alte temperature
pH alcalino estremo (>13)
Bassa forza ionica [Na+]
Presenza in soluzione di sostanze che
rompono i ponti a idrogeno (urea,
formamide).
La denaturazione della doppia elica si
accompagna a grosse variazioni delle proprietà
fisiche delle soluzioni di DNA
1. Diminuzione della viscosità
2. Aumento di assorbanza a 260nm
3. Variazione dell’attività ottica
Curve di denaturazione
La denaturazione non è un processo irreversibile.
Infatti se dopo la separazione delle eliche si fa
scendere gradualmente la temperatura, le singole
eliche complementari si possono riappaiarea
doppia elica può riformarsi. Questo processo si
chiama ibridazione.
La discesa graduale della temperatura e la
permanenza delle molecole per un certo tempo
pochi gradi al di sotto della temperatura di
denaturazione sono fondamentali affinchè ci
possa essere ibridazione, processo dipendente
dai moti di agitazione termica. Se dopo la
denaturazione la soluzione viene portata a
bassa temperatura non si ha ibridazione, ma
stabilizzazione della struttura secondaria delle
singole catene.
Per mezzo dell’ibridazione si possono
formare delle doppie eliche di DNA-DNA,
DNA-RNA o RNA-RNA. La condizione
fondamentale perché ciò avvenga è che in
soluzione si mettano molecole con sequenza
complementare (antiparallele). L’ibridazione
è una forma di riconoscimento molecolare
estremamente specifica.
In condizioni
opportune di
temperatura e forza
ionica (stringenza) si
possono ottenere
anche delle eliche in
cui sono tollerati degli
appaiamenti non
perfetti
Effetti della stringenza di ibridazione
Cinetiche di rinaturazione
Sintesi chimica
oligonucleotidi:
Con questo sistema si
possono sintetizzare in vitro
singoli filamenti di DNA di
grandezza compresa
tra 6 e 100 nucleotidi
Metodi di marcatura degli acidi nucleici
Le DNA polimerasi batteriche possono essere
purificate e utilizzate per sintetizzare DNA in vitro
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
Primer sintetico
3’
5’
5’
3’
DNA stampo (singolo filamento)
DNA polimerasi
Le DNA polimerasi batteriche possono essere
purificate e utilizzate per sintetizzare DNA in vitro
DNA polimerasi
5’
5’
3’
DNA stampo (singolo filamento)
Le DNA polimerasi batteriche possono essere
purificate e utilizzate per sintetizzare DNA in vitro
3’
5’
5’
3’
Traccianti utilizzati
Nucleotidi marcati con isotopi radioattivi
Traccianti utilizzati
Nucleotidi marcati con sostanze non radioattive
Traccianti utilizzati
Nucleotidi marcati con sostanze non radioattive
- Fluorocromi (marcatura diretta)
- Enzimi (perossidasi, fosfatasi alcalina)
- Digossigenina (riconosciuta da anticorpi specifici
marcati con fluorocromi o enzimi)
- Biotina (riconosciuta da avidina marcata con
fluorocromi o enzimi)
Traccianti utilizzati
Fluorocromi
Marcatura di DNA mediante random priming
Esempio di ibridazione: FISH
(fluorescent in situ hybridization)
Come si fa a vedere se un gene è espresso?
Purificazione dell’mRNA
(non obbligatoria)
• L’mRNA rappresenta il 2-4 %
dell’RNA totale presente nelle cellule.
• L’mRNA può essere purificato
mediante cromatografia di affinità con
oligo-dT legata a diversi supporti solidi.
• L’mRNA purificato prende anche il
nome di poly-A+, e rappresenta la base
per diverse procedure di analisi di
espressione, oltre che per la sintesi del
cDNA necessario alla produzione di
genoteche.
Northern Blotting
-
28S
18S
7S
+
• L’RNA (totale o poly-A+) viene
frazionato mediante corsa elettroforetica
su gel di agarosio deneturante (il gel
contiene formaldeide, e preima della corsa
i campioni vengono denaturati in
formamide). Questo è necessario per far sì
che le molecole di RNA si separino in base
al loro peso molecolare, e non in base alla
forma. Dopo la corsa si procede come per
il Southern blot.
Cella elettroforetica per gel di agarosio
Northern Blotting
Northern Blotting: e dopo il trasferimento?
• Saturazione dei siti a cui la sonda potrebbe legarsi in modo
non-specifico (macromolecole di vario genere, in particolare si
usano proteine e DNA a singolo filamento non marcato)
• Ibridazione con sonda marcata
• Lavaggi per eliminare la sonda legata debolmente al filtro e
non ibridata in modo corretto
• Visualizzazione del segnale (ad es. se la marcatura è
radioattiva si fa una autoradiografia)
Caratteristiche del Northern Blotting
• Tecnica non particolarmente sensibile. La sensibilità può essere
aumentata notevolmente se invece dell’RNA totale si usa l’RNA polyA+. Infatti il quantitativo di RNA che si può caricare su un gel di
agarosio è 50 mg. Se invece di caricare RNA totale carico un uguale
quantitativo di poly-A+, posso avere un segnale fino a 50 volte
maggiore.
• L’uso di mRNA purificato elimina anche la possibilità di ibridazione
non-specifica con l’rRNA.
• Può essere applicata alla misurazione dell’espressione di un singolo
gene
• Oltre a misurare i livelli di espressione permette di valutare il peso
molecolare dei trascritti, e consente di caratterizzare eventuali isoforme
alternative .
• Questa tecnica richiede che l’RNA sia il più integro possibile. Anche
solo una rottura per molecola di mRNA determina una forte riduzione
del segnale specifico.
Esempio di Northern Blotting su RNA da tessuti
A BCD E
mRNA
F
AAAAAAA
Sonda1
Sonda 2
Sonda1
B
L K
H
Sonda2
M
B
L K
H
M
Ibridazione in situ
• Questa metodica si basa sull’ibridazione di sonde marcate direttamente
su cellule o tessuti. Si può ibridare su sezioni istologiche o su materiale non
sezionato (in quest’ultimo caso si parla whole-mount).
• E’ l’unica tecnica che permette di localizzare l’espressione di un dato
mRNA a livello delle singole cellule.
• Ideale per studiare i geni espressi in un gruppo ristretto di cellule
all’interno di un tessuto, o i geni la cui espressione è modulata nel tempo e
nello spazio (estremamente utilizzata negli studi di biologia dello sviluppo).
Ibridazione in situ
Esempi
Ibridazione in situ ‘whole mount’
Esempi
Misurazione espressione a livello della proteina
Western Blotting
SDS-PAGE
Misurazione espressione a livello della proteina
Western Blotting
Electroblotting
Misurazione espressione a livello della proteina
Western Blotting
Immunodetection
Misurazione espressione a livello della proteina
Immunofluorescenza ed immunoistochimica
Permettono di valutare in quali cellule e in quali strutture
subcellulari sono localizzate le proteine
Saggi di ibridazione inversa
Sia i macroarrays che i microarrays sono stati sviluppati per soddisfare
l’esigenza di misurare contemporaneamente l’espressione di più geni.
Entambe le tecnologie si basano sullo stesso principio:
1. Come sonda si usano olgonucleotidi
o molecole di cDNA non marcati,
immmobilizzati in posizioni precise di
un supporto solido
A
B
C
D
1
a
b
g
d
2
e
z
h
q
3
i
k
l
m
4
n
x
o
Array
p
2. L’array viene ibridizzato con una
miscela complessa di molecole
marcate rappresentative
dell’mRNA espresso dalle cellule in
esame
mRNA
RT
Nucleotidi marcati
cDNA
Macrorray
• Le molecole sonda vengono legate a membrane di nylon
• Come tracciante viene utilizzata la radioattività
• Analisi di qualche decina o poche centinaia di geni
Microrray di cDNA (o di oligonucleotidi lunghi)
• Le molecole sonda sono cDNA o oligonucleotidi lunghi 70-80
paia di basi, sintetizzati tradizionalmente e egati ad un
vetrino da microscopio per mezzo di un processo di stampa a
getto.
• Su ogni vetrino trovano posto fino a 10000 geni.
• Metodica che si usa per comparare le differenze di
espressione genica tra due campioni.
cDNA Microarray
mRNA
Reverse
transcription
Labeled
1st strand cDNA
Sample 1 (test)
Sample 2 (reference)
Hybridization on the cDNA microarray
Generazione di una enorme
quantità di dati.
L’acquisizione dei dati è solo la
parte iniziale della procedura. La
parte più complicata è
l’elaborazione della enorme
quantità di dati generati da questi
esperimenti, necessaria per
rispondere ai quesiti biologici di
partenza. I dati più significativi
devono essere poi verificati con
altri sistemi (northern, real time
RT-PCR)
Applicazioni
Definizione delle basi
molecolari e identificazione
di nuovi markers prognostici
per neoplasie e altre
patologie
Applicazioni
Farmacogenomica e tossicogenomica
Misurazione espressione a livello della proteina
2D-Gel electrophoresis