Tecniche di ibridazione degli acidi nucleici
e
marcatura degli acidi nucleici
Tecniche di base della biologia molecolare, che permettono non solo
di identificare e quantificare sequenze specifiche di DNA e di RNA,
ma di studiarne l’organizzazione, la localizzazione intra-cellulare,
l’espressione, ecc.
L’ibridazione di acidi nucleici immobilizzati su supporti solidi è la
pietra miliare dei metodi di rivelazione dei geni e dei prodotti genici
che ha rivoluzionato la nostra comprensione della struttura dei geni,
dell’organizzazione del genoma e del controllo dell’espressione dei
geni
Il DNA bersaglio (complessa ed eterogenea popolazione di molecole di
acido nucleico normalmente immobilizzate su supporto solido)
La sonda (popolazione omogenea di molecole a sequenza nota marcate)
La prima di queste tecniche, il Southern blotting, fu sviluppato da
Edwin S. Southern nel 1975 per identificare all’interno di un gel,
frammenti di DNA complementari ad una determinata sequenza di
DNA.
Il metodo è diventato molto importante dopo lo sviluppo del clonaggio
molecolare, che ha reso possibile una miriade di sonde specifiche per
i geni. Successive tecniche analoghe per lo studio di RNA e proteine
sono state chiamate Northern e Western blotting, rispettivamente.
Tecnica
sonda/bersaglio
Tipo di marcatura
_______________________________________________________________
Southern blotting
DNA su DNA
DNA o oligonucleotidi
radioattivi o fluorescenti
Northern blotting
DNA su RNA
Western blotting
proteine su proteine
“ “
anticorpi coniugati ad
enzimi o chemioluminescenti
Southern blotting
Fasi sperimentali:
1. Il DNA da analizzare è digerito con enzimi di restrizione e
risolto per elettroforesi su gel di agarosio.
2. I frammenti di DNA sono denaturati in una soluzione
alcalina (NaOH 0,5M, NaCl 1M) e poi il gel è immerso in un
tampone di neutralizzazione, per riportare il pH a valori
simili a quello del tampone di trasferimento (questo
passaggio è necessario quando si usa la nitrocellulosa
perché essa viene distrutta da un pH alcalino).
Per il trasferimento di frammenti di grosse dimensioni il gel
può essere immerso in HCl 0,25N per 10 min prima della
denaturazione; il trattamento acido depurina il DNA*che
durante il trattamento basico è idrolizzato a livello dei siti
depurinati. Questo trattamento assicura che tutti i frammenti
sono trasferiti velocemente dal gel al filtro.
* Per depurinazione si intende la perdita di una base azotata
purinica (A o G) da un nucleotide per rottura del legame
glisosidico)
3. Il ssDNA o l’ RNA è trasferito per capillarità (blotting) dal gel
su una membrana (filtro) di nitrocellulosa o di nylon.
Il legame del DNA
o dell’RNA ad una
membrana di
nitrocellulosa
(baking) comporta
interazioni
idrofobiche, legami
idrogeno e ponti
salini
4. Baking
Dopo il trasferimento, i frammenti di DNA sono fissati sul filtro per
impedirne il distacco, mediante trattamento a 80°C (nitrocellulosa) o
trattamento ai raggi UV che creano legami crociati tra i residui di
Timina del DNA e i gruppi amminici della membrana di nylon.
5. Ibridazione. Dopo la fissazione del DNA, il filtro è posto in una
soluzione contenente la sonda marcata (DNA, RNA, oligo), la cui
sequenza è complementare al frammento da identificare
Se la sonda è a doppio filamento deve essere denaturata prima di
essere aggiunta alla miscela
Le interazioni tra la sonda e il suo filamento complementare porterà
alla formazione di legami idrogeno che permettono la formazione di
una doppia elica.
Le condizioni di ibridazione sono scelte in modo da massimizzare la
quantità di sonda legata al DNA bersaglio, limitando al tempo stesso
il legame non specifico con altri frammenti di DNA o con il filtro
stesso (segnale di fondo).
6. Dopo l’ibridazione, il filtro è lavato più volte per eliminare la
sonda in eccesso e per rimuovere la sonda legata in modo
aspecifico (differenti condizioni di stringenza).
DNA and RNA blotting
Total RNA loaded on denaturating agarose gel
23S
16S
5S
Denaturation
DNA alkali treatment
RNA  formaldehyde gel
Controllo della stringenza
Stringenza: specificità con cui una sonda si ibrida alla sequenza
bersaglio.
Una stringenza elevata si ottiene aumentando la temperatura e
diminuendo la salinità (forza ionica) del tampone.
La Tm (temperatura di fusione o melting T) caratterizza la stabilita’
dell’ibrido che si forma tra la sonda e il suo filamento complementare.
La Tm e’ critica per determinare la temperatura ottimale alla quale
condurre l’ibridazione.
Per sonde più lunghe di 100 bp:
Tm = 81,5 °C + 16,6 log M + 0,41 (% C+G)
Per oligonucleotidi ( 20 basi):
Tm = 4 °C (numero di G +C) + 2°C (numero A +T)
Componenti dei tamponi di ibridazione
Destran solfato e polimeri simili che agiscono da “riempitivi, cioè
riducono il volume di reazione e aumentano la velocità e l’efficienza
d’ibridazione;
Detergenti (SDS) o agenti bloccanti (Denhardt) che diminuiscono la
percentuale di legami non-specifici tra sonda e membrana;
Agenti denaturanti (formammide e urea) che diminuiscono la
temperatura di denaturazione dell’ibrido; l’aggiunta di queste sostanze
permette di abbassare la temperatura d’ibridazione;
DNA eterologo (DNA di salmon sperm) che satura i siti di legame sulla
membrana che potrebbero interagisce con la sonda (riduce i segnali
aspecifici).
Northern blotting analysis
virF
fis
+
_
virB
+
Arb.Units
1.2
_
virG
+
_
icsB
cpxR
+
+
_
_
A
B
0.6
0
C
DNA labeling
1) Random primer
Denaturation (boil 5’)
Hexaprimers added
Hybridization
DNA synthesis with Klenow
polymerase (1 hour at 37°C)
and a mix of four dNTPs
containing [a-32P]dATP
Labeled
probe
Denaturation (boil 5’)
2) Nick translation
DNA degradation
Add a32P-dATP or a32P-CTP
End-labeling
1- Fill-in
reaction
5’-GGG
G-3’
3’-CCC
SmaI
CTTAA-5’
EcoRI
5’-GGG
GAATT-3’
3’-CCC
SmaI
CTTAA-5’
EcoRI
dTTP +
a[32P]dATP
+ Klenow
fragment
dGTP + dTTP + dCTP +
a[32P]dATP + Klenow fragment
5’
5’ protruding end
3’
5’
3’
3’ protruding end
(PstI, SacI, KpnI, BglI)
DNA fragment
5’…..pNpNpNpG
CIP or BAP
2- Kinase
reaction 3’……NpNpNpCpTpTpAp
5’……NpNpNpG
3’……NpNpNpCpTpTpA
5’…..pNpNpNpG
3’……NpNpNpCpTpTpAp
*
Polynucleotide
Kinase +
g[32P]ATP
*
Marcatura non radioattiva
Marcatura con Biotina
Si basa sull’incorporazione nel DNA di un analogo di un nucleotide
contenente la biotina, una vitamina (biotina-7-dATP, biotina-14dATP), mediante nick translation o random priming.
Dopo ibridazione, la sonda marcata con biotina può essere rilevata
mediante il legame forte e specifico con la streptavidina, coniugata
con fosfatasi alcalina o perossidasi. Il complesso può essere
evidenziato aggiungendo un substrato cromogenico o
chemiluminescente.
La streptavidina è una proteina extra-cellulare del batterio
Streptomyces avidinii, costituita da 4 subunità identiche, ciascuna
delle quali lega una molecola di biotina.
Substrato cromogenico BCIP/NBT
della fosfatasi alcalina
colore indaco
colore blu intenso
Biotina-oligo
La colorazione viene prodotta dalla
combinazione del
5-bromo-4cloro-3-indolil fosfato (BCIP) con il
nitroblu tetrazolio cloruro (NBT).
La fosfatasi alcalina rimuove il
gruppo fosfato del BCIP,
producendo un molecola che
dimerizza in condizioni ossidanti
per formare il 5,5’-dibromo-4,4’-dicloro-indaco, un prodotto insolubile
indaco. Il colore indaco è amplificato dall’aggiunta di NBT. L’ NTB
viene ridotto dall’indolil e produce un colorante blu intenso NBT
formazano.
Nonradioactive DNA probe
Biotin
Probe
Target
DNA
Biotin-labeled nucleotides are incorporated into the DNA probe by
random primer or nick translation methods
Streptavidin
Biotin-labelled
alkaline phosphatase
or peroxidase
Substrate
Light-emitting
product or
chromogenic
substrates change
color
Marcatura con Digossigenina
La digossigenina (DIG) è uno steroide cardiotonico isolato da
Digitalis purpurea, una pianta erbacea.
Il metodo si basa sull’incorporazione della digossigenina-11-dUTP
nel DNA mediante nick translation o random priming.
La sonda così marcata viene rivelata da un sistema immunoenzimatico che usa un anticorpo diretto contro la digossigenina
(anti-DIG) coniugato con la fosfatasi alcalina. Si forma così un
complesso che può essere evidenziato aggiungendo un substrato
cromogenico o chemiluminescente della fosfatasi alcalina.
La specificità dell’ anti-DIG per la DIG fornisce un’alta sensibilità di
rilevazione.
appaiamento
U-A
Dig-dUTP
Deossiuridina trifosfato
che mediante un braccio
spaziatore porta legata la
digossigenina
Cutting and joining DNA molecules
After a restriction endonuclease cuts DNA fragments can be joined.
Features of Bacteriophage T4
DNA Ligase
Polypeptide of MW=68.000
Requires ATP (the E.coli enzyme
requires NAD+). The cofactor forms
an enzyme-AMP complex.
The complex binds to the nick and
catalyzes the formation of a covalent
bond in the phosphodiester chain.
The optimum temperature for ligation
of DNA is 37°C but at this
temperature the hydrogen-bounded
joint between the sticky ends is
unstable (the reaction is usually
carried out at 15°C).
Substrate: This enzyme is active on
double strand DNA with blunt ends or
complementary cohesive ends that
base pair to bring together 3’-OH and
5’-phosphate termini.
AMP
T4 DNA Ligase
An enzyme-AMP complex
binds to a nick bearing
3’-OH and 5’-P groups.
The AMP reacts with the
phosphate group which is
attacked by the 3’-OH.
Dephosphorylation
of 5'-ends of DNA
Application of alkaline
phosphatase treatment to
prevent recircularization
of vector plasmid without
insertion of foreign DNA.
Using DNA linkers
A decameric linker molecule containing
an EcoRI site is joined by T4 DNA
ligase to both ends o a blunt-ended
foreign DNA. Cohesive ends are then
generated by EcoRI.
Cloning a cDNA
1)
2)
3)
4)
mRNA is copied into doublestranded cDNA and SalI
linkers (S) are added.
The hairpin loop formed by
self-priming of the second
strand synthesis is removed by
S1 nuclease.
EcoRI linkers are the ligated to
the duplex molecule and
cohesive termini are generated
by restriction with SalI and
EcoRI.
The cDNA plus linkers is then
ligated into a vector cut with
the same two enzymes.
Sintesi di code omopolimeriche con terminal transferasi
Le estremità 3’
protrudenti, quali quelle
generate dalla
esonucleasi del fago
lambda o da alcuni
enzimi di restrizione
(PstI) sono i substrati
migliori per l’azione
dell’enzima terminal
transferasi.
Formazione di molecole circolari
Saldatura di frammenti prodotti mediante PCR
Le polimerasi termostabili usate per amplificare il DNA possiedono attività
di terminal transferasi. La Taq aggiunge un dATP all’estremità 3’ del
prodotto di amplificazione.
-Metodo del T/A cloning.
-DNA polimerasi I
(attività 3’-5’ eso).
-Incorporazione di
sequenze extra al 5’ dei
primers.
Siti di taglio degli enzimi di restrizione
DNA donatore
Frammenti di restrizione
Vettore ricombinante
contenente l’inserto 1
oppure il 2
Trasformazione
Replicazione e
divisione
cellulare
Clone del
frammento 1 del
donatore
Clone del
frammento 2 del
donatore
Schema della costruzione di un plasmide ricombinante,
e della successiva propagazione (amplificazione
operata dalle cellule batteriche).