ZytoLight
SPEC EGFR/CEN 7 Dual Color
Probe
Z-2033-200
20 (0.2 ml)
Z-2033-50
5 (0.05 ml)
Per la rilevazione del gene umano EGFR e degli
alfa-satelliti del cromosoma 7 mediante ibridazione
in situ fluorescente (FISH)
.
.
.
.
Dispositivo per uso diagnostico in vitro
in base alle direttive EU 98/79/EC
Sonda polinucleotide marcata in fluorescenza per il rilevamento del gene
umano EGFR e degli alfa-satelliti del centromero del cromosoma 7.
Pronto all’uso
Descrizione Prodotto:
Contenuto:
Sonda ZytoLight EGFR/CEN 7 Dual Color
Probe (PL15) in tampone di ibridazione. La
sonda contiene polinucleotidi coniugati
con un fluorocromo verde (ZyGreen,
analogo alla FITC, eccitazione a 503 nm ed
emissione a 528 nm) che marca il gene
EGFR e polinucleotidi coniugati con un
fluorocromo arancio (ZyOrange, analogo
alla Rodamina, eccitazione a 547 nm ed
emissione a 572 nm) che marca la
sequenza
degli
alfa
satellite
del
centromero del cromosoma 7
Prodotto:
Z-2033-200: 0.2 ml (20 reazioni considerando
10 μl di dispensazione per campione)
Z-2033-50: 0.05 ml (5 reazioni considerando
10 μl di dispensazione per campione)
Specificità:
La sonda ZytoLight EGFR/CEN 7 Dual Color
Probe (PL15) è progettata per rilevare il
gene umano EGFR cosi come gli alfasatelliti del centromero del cromosoma 7 in
tessuti fissati in formalina ed inclusi in
paraffina o in campioni cellulari tramite
ibridazione in situ fluorescente.
Stabilità/Conservazione:
La sonda ZytoLight EGFR/CEN 7 Dual Color
Probe (PL15) deve essere conservata a
-16/-22°C al buio ed è stabile fino alla data
indicata sull’etichetta.
Utilizzo:
Questo prodotto è un dispositivo per uso
diagnostico in vitro (in base alle direttive EU
98/79/EC). L'interpretazione dei risultati
deve essere effettuata da personale
qualificato tenendo conto degli altri dati
clinici e patologici del paziente nel
contesto dell'anamnesi clinica.
Precauzioni:
Leggere il manuale d’uso prima dell’utilizzo!
Non usare i reagenti dopo la data di
scadenza riportata sull’etichetta. Questo
prodotto contiene sostanze (in piccoli
volumi e piccole concentrazioni) dannose
per la salute. Evitare il contatto diretto con i
reagenti. Prendere le appropriate misure
protettive (guanti
monouso, occhiali
protettivi, abbigliamento da laboratorio).
Se i reagenti vengono in contatto con la
pelle lavare abbondantemente con
acqua.
Principio del Metodo:
La presenza di determinate sequenze di acido nucleico nelle cellule o
nei tessuti può essere rilevata attraverso ibridazione in situ con l'utilizzo di
sonde a DNA marcate. L'ibridazione induce la formazione di una
struttura a doppio filamento (ibrido duplex) tra le sequenze presenti nel
campione in analisi e la sonda.
La formazione del duplex (con le sequenze cromosomiche del gene
EGFR e degli alfa satelliti del cromosoma 7 nel campione) può essere
visualizzata attraverso l'utilizzo di un microscopio a fluorescenza con filtri
appropriati
Istruzioni:
Il pretrattamento (sparaffinatura, proteolisi, post fissazione) piuttosto
che l’allestimento del campione dovrebbero essere ottimizzati
dall’utilizzatore a seconda della natura del campione e dei propri
bisogni.
Denaturazione e ibridazione
1. Utilizzare 10µl di ZytoLight EGFR/CEN 7 Dual Color Probe (PL15)
per ogni campione.
Distribuire a piccole gocce sull'intera superficie evitando di
concentrare in un unico punto. Alternativamente, aggiungere la
sonda al centro di un coprioggetto e applicare il coprioggetto
sull'area in esame. Un leggero riscaldamento della sonda e l'utilizzo
di un puntale tagliato in punta semplificano l'operazione.
2. Evitare la formazione di bolle, coprire il campione con un vetrino
copri oggetto (22 mm x 22 mm a seconda della dimensione del
campione). Sigillare il vetrino copri oggetto con fixogum o con
colla analoga.
3. Denaturare a 75°C (± 2°C) per 10 minuti utilizzando una piastra
calda
La temperatura di denaturazione può dipendere da vari fattori come la
fissazione o l’età del campione pertanto potrebbe essere necessaria
l’ottimizzazione di tale temperatura (73°C-77°C)
4. Trasferire i vetrini in una camera umida e ibridare overnight a 37°C
in una stufa ventilata
E’ importante che il campione (cellule o tessuto) non si asciughino durante
l’ibridazione
E’ possibile condurre le fasi di denaturazione/ibridazione mediante
l’utilizzo di piastre a controllo automatico della temperatura come il
ThermoBrite™ StatSpin.
Risultati
Mediante l’utilizzo di filtri appropriati, i segnali di ibridazione del gene
EGFR appariranno verdi mentre i segnali di ibridazione dei alfa satelliti
del cromosoma 7 appariranno arancio. In interfase le cellule normali o
le cellule senza aberrazione del cromosomi 7 si distingueranno due
segnali distinti uno verde ed uno arancione.
In cellule con amplificazione del gene EGFR si avrà un aumento dei
segnali gene specifici o la formazione di cluster di segnale.
I polinucleotidi della sonda ZytoLight EGFR/CEN 7 Dual Color Probe
(PL15) che riconoscono gli alfa satelliti del centromero del cromosoma
7 fungono da controllo interno per garantire che l’ibridazione è
avvenuta correttamente.
Al fine di valutare la specificità del segnale, ogni ibridazione dovrebbe
essere effettuata assieme a dei controlli. Si consiglia l’utilizzo di almeno
un campione in cui il numero di copie del gene EGFR e del cromosoma
7 sia noto.
Particolare attenzione si deve prestare nella valutazione di cellule
sovrapposte onde evitare falsi risultati tipo amplificazione del gene.
A causa della de condensazione della cromatina, singoli segnali FISH
possono apparire come piccoli cluster, comunque due o tre segnali
della stessa dimensione, separati da uno spazio pari alla dimensione di
un segnale, devono essere considerati come un unico segnale.
Bibliografia
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Wilkinson DG: In Situ Hybridization, A Practical Approach, Oxford University Press
(1992)
ISBN 0 19 963327 4.
Ultima versione: 11 Gennaio 2010 (4.5)
Marchi di fabbrica:
ZytoVision® e ZytoLight ® sono marchi di fabbrica della ZytoVision