Metodi per studiare
l’espressione dei geni
• Northern blot
• Trascrittasi Inversa -PCR (RT-PCR)
• Ibridazione In situ
• Trascrizione In vitro
• DNA Microarray
Purificazione dell’RNA
• Procedura
– Lisi delle cellule con un reagente
che dissocia le nucleoproteine e
inibisce la RNAsi
– Rimozione delle proteine
– Precipitazione specifica dell’RNA
Northern blot
• Per determinare la dimensione e la
quantita’ di specifici mRNA
• Studi sull’espressione genica
Northern blot
– Elettroforesi dell’RNA in gel contenente
formaldeide per mantenere l’RNA in
forma completamente lineare
– Trasferimento dell’RNA su una
membrana
– Ibridazione con una sonda marcata
tampone elettroforetico
es. TAE (4mM Tris-acetato, 1mM EDTA, pH 8.0)
generatore di corrente
gel di agarosio
100V
-
+
0,2A
scatola elettroforetica
Gel ElettroforesiSepara le molecole in base alla dimensione
Trasferimento su supporto solido
Trasferimento dal gel alla
membrana
Preparare la sonda per il Northern Blot
Ibridazione
• La sonda marcata e’ aggiunta ad una
soluzione contenente il supporto solido che
lega l’RNA da analizzare
Lavaggio
• Rimozione della sonda non legata al
supporto solido
Rivelazione degli ibridi
• Esposizione di un film se la sonda e’
marcata radioattivamente
• Se la sonda e’ marcata con un enzima si
procede alla reazione enzimatica che
produce colore direttamente sul supporto
solido
Dopo il trasferimento
gel
membrana
Northern blot
• La rivelazione avviene usando:
– DNA marcato con radioattivo(32P)
– DNA marcato con un enzima che
catalizza una reazione che produce
luce o colore
Northern blot
Fig. 5. Northern blot analysis of E. lagascae total RNA from leaves (L), germinating
seeds (Se), roots (Ro) and stems (St). The blot was hybridized with probes for ElLTP1
(top panel) and ElLTP2 (middle panel). The bottom panel shows ethidium bromide
staining of the gel before blotting. The numbers to the left indicate approximate
transcript sizes in kb
Svantaggi del Northern Blot
• Richiede grandi quantita’ di RNA
• E’ un processo lungo e laborioso
Trascrittasi Inversa- PCR
• Rivelazione di mRNA molto rari
• Analisi di RNA con pochissime
quantita’
Procedura
• Purificazione dell’RNA
• Aggiungere i primer
• mescolare RNA con la trascrittasi inversa
per effettuare la sintesi del primo
filamento di cDNA
• Aggiungere la DNA polimerasi
termostabile per effettuare la sintesi del
secondo filamento di cDNA e per
amplificarlo con i cicli della PCR
Trascrittasi inversa - PCR (RT-PCR)
mRNA 5’
Primer 1
3’
AAAAA 3’
TTTTT 5’
reverse transcriptase
(RNA-dependent DNA polymerase)
AAAAA 3’
TTTTT 5’
mRNA 5’
cDNA 3’
Remove RNA
(RNase A)
cDNA 3’
TTTTT 5´
Add PCR primers
Primer 2 5’
3’
TTTTT
3’
5’
Primer 3
Add Taq polymerase. Run PCR
Reverse transcriptase-PCR (= RT-PCR)
Epoxide hydrolase
+ + + + - - - l
2027
1904
1584
947
831
564
l se r st l se r st pl
RT
Ibridazione dell’RNA in situ
Rivelazione di mRNA direttamente su tessuti messi su
vetrini da microscopio
Preparation of RNA probe with in vitro transcription
T7/T3 or SP6
promoter
RNA in situ hybridization
Colour substrate:
nitro blue tetrazolium (NBT)
+ 5-bromo-4-chloro-3indolyl phosphate (BCIP)
Fig. 7. RNA in situ hybridization with antisense (a-c) and sense (d) RNA probes for ElLTP1.
E. lagascae seedlings were collected 7 days after sowing. co Cotyledon, en endosperm,
hy hypocotyl, am apical meristem, ro root
Northern blotting
RNA isolation
Probe labeling
AAAAAA
dCTP
dGTP
dTTP
dATP
pBS-SemaIII
Gel electophoresis
Hybridization
Blotting
Autoradiography
reverse Northern blotting
Northern
reverse Northern
specific probes
*
*
labeled target
cDNA arrays (continued)
• macro-arrays
– low-density
– filter-supported
– radioactive probes
(duplicates)
– low sensitivity
– only cDNA clones
spotted
– cheap
cDNA arrays (continued)
• micro-arrays
– high-density
– glass-supported
– fluorescent probes
(single slide)
– high sensitivity
– ability to spot
oligonucleotides
– very expensive
Tessuto della prostata,
normale
Tessuto della prostata,
tumorale
In questo esempio i cDNA
sono stati posizionati su di un
vetrino, simile ai normali
vetrini usati per l’istologia.
I microarrays
Un microarray è un supporto solido
sul quale sono stati posizionati
diverse migliaia di cDNA in spot
separati. Ciascuno spot rappresenta
un gene, in quanto contiene
numerose copie di un cDNA
corrispondente a tale gene.
Microarray technology
Probes
Microarray synthetized by photolithography or EST/oligo “linking”
http://www.ym.edu.tw/excellence/HBP/HBP_CP4/procedure.htm
Tessuto della prostata,
normale
Tessuto della prostata,
tumorale
utilizzo dei microarrays
si confrontano i profili di
espressione genica di due campioni
differenti.
E’ necessario estrarre le molecole di
mRNA dai due campioni.
Estrazione
dell’mRNA dai
2 campioni di
cellule che si
vogliono
confrontare
Conversione in
cDNA
Marcatura con
2 fluorocromi
diversi
Confronto dei profili di espressione genica in
due campioni cellulari diversi
(1)
(2)
(3)
(6)
Immagine a colori
raffigurante il
microarray
Eccitazione della
fluorescenza
tramite laser
Riconoscimento (4)
tra i cDNA
provenienti dai 2 campioni e
quelli già presenti sul microarray
(5)
Confronto dei profili di espressione genica in
due campioni cellulari diversi
I puntini gialli corrispondono a geni
che sono espressi in uguale quantità
nei due campioni.
I puntini verdi corrispondono a geni
maggiormente espressi nel campione
marcato col fluorocromo che emette
fluorescenza verde (ad esempio nelle
cellule normali).
I puntini rossi corrispondono a geni
che sono maggiormente espressi nel
campione marcato col fluorocromo
che emette fluorescenza rossa (ad
esempio nelle cellule tumorali).