Arrays di acidi nucleici
Sia i macroarrays che i microarrays sono stati sviluppati per soddisfare
l’esigenza di misurare contemporaneamente l’espressione di più geni.
Entambe le tecnologie si basano sullo stesso principio:
1. Come sonda si usano olgonucleotidi
o molecole di cDNA non marcati,
immmobilizzati in posizioni precise di
un supporto solido
A
B
C
D
1
a
b
g
d
2
e
z
h
q
3
i
k
l
m
4
n
x
o
Array
p
2. L’array viene ibridizzato con una
miscela complessa di molecole
marcate rappresentative
dell’mRNA espresso dalle cellule in
esame
mRNA
RT
Nucleotidi marcati
cDNA
I saggi di microarray sono basati sul principio
dell’ibridazione inversa
Macrorray
• Le molecole sonda vengono legate a membrane di nylon
• Come tracciante viene utilizzata la radioattività
• Analisi di qualche decina o poche centinaia di geni
Microrray: tecnologia Affymetrix
• Le molecole sonda sono oligonucleotidi sintetizzati
direttemente su microchip di silicio con un metodo
fotolitografico.
• Su ogni microchip vengono sintetizzati fino a 400000
oligonucleotidi diversi.
•La metodica è stata sviluppata in modo da permettere
misurazioni assolute dell’abbondanza dei singoli mRNA
Schema metodica
mRNA
TGAACTGATAGATGACGTAG
Poly A
Design complementary oligo
ACTTGACTATC TACTGCATC
Chemically synthesize
oligo on chip
107- 108 identical
oligos per feature
Label –
Label –
Hybridize labeled total mRNA
Detect label
Microrray: tecnologia Affymetrix
50µm
~ 50 - 400
chips/wafer
50µm
Thousands of identical
probes/feature
1.28cm
1.28cm
up to ~ 400,000 features/chip
Sintesi fotolitografica
Lamp
Mask
Chip
Ibridazione e rivelazione
Biotin
Biotin
7
8
10 -10 identical
probes/feature
Phycoerythrin
Phycoerythrin Streptavidin
Streptavidin
Biotin
Biotin
Rappresentazione di ogni trascritto sul chip
Perfect Match
mRNA
*
Mismatch
*
*
*
*
*
Perfect Match
Mismatch
• Per ogni gene vengono sintetizzati 20 oligonucleotidi
uguali all’mRNA (perfect match).
• Per ognuno di questi, ne viene sintetizzato un altro con
una base sbagliata (mismatch).
• L’espressione del gene si ottiene sommando le letture dei
perfect match e sottraendo quelle dei mismatch.
• Questi accorgimenti sono indispensabili per eliminare i
problemi dovuti alla eventale ibridizzazione disugule o
non specifica degli oligonucleotidi.
Letture possibili
Detectable
Perfect Match
Mismatch
Undetectable
Undetectable
PIN
PRINTING
INK JET PRINTING
cDNA Microarray
Modalità di marcatura
Modalità di marcatura
Microrray di cDNA (o di oligonucleotidi lunghi)
• Le molecole sonda sono cDNA o oligonucleotidi lunghi 70-80
paia di basi, sintetizzati tradizionalmente e egati ad un
vetrino da microscopio per mezzo di un processo di stampa a
getto.
• Su ogni vetrino trovano posto fino a 20000 geni.
• L’intensità del segnale per ogni gene dipende dai livelli di
messaggero e dall’efficienza di ibridazione. Pertanto questa
metodica non consente misurazioni assolute ma solo relative.
• Metodica comparativa.
• Per confrontare tra di loro più campioni è necessario
confrontarli tutti con un campione standardizzato.
mRNA
Reverse
transcription
Labeled
1st strand cDNA
Sample 1 (test)
Sample 2 (reference)
Hybridization on the cDNA microarray
Bead Arrays
Analisi statistica a tutti i livelli
Identificazione degli spot
Analisi statistica a tutti i livelli
Eliminazione degli artefatti
Analisi statistica a tutti i livelli
Normalizzazione
Analisi statistica a tutti i livelli
Identificazione dei geni modulati
Analisi statistica a tutti i livelli
Clustering dei dati
Analisi statistica a tutti i livelli
Clustering dei dati
Attenzione !!!
L’enorme numero di geni analizzati dai
microarray è il punto più forte, ma anche più
debole della metodica. Infatti sono possibili
moltissimi errori (importanza di avere
campioni replicati), e il trattamento
dell’informazione non è banale! L’acquisizione
dei dati è solo la parte iniziale della procedura.
La parte più complicata è l’elaborazione della
enorme quantità di dati generati da questi
esperimenti, necessaria per rispondere ai
quesiti biologici di partenza. I dati più
significativi devono essere poi verificati con
altri sistemi (northern, real time RT-PCR)
Importanza della bioinformatica per la determinazione
del significato biologico degli esperimenti
Applicazioni
1. Definizione delle basi
molecolari e
identificazione di nuovi
markers prognostici per
neoplasie e altre patologie
Applicazioni
1. Definizione delle basi
molecolari e
identificazione di nuovi
markers prognostici per
neoplasie e altre patologie
Applicazioni
2. Studio del controllo trascrizionale. In particolare,
identificazione dei siti di legame per i fattori trascrizionali
coinvolti nella coregolazione
Applicazioni
Applicazioni
3. Annotazione del genoma, ossia identificazione delle regioni
effettivamente trascritte
Applicazioni
4. Farmacogenomica e tossicogenomica