Array di oligonucleotidi
Questo tipo di array si ottiene sia con la sintesi diretta di
oligonucleotidi sul supporto oppure per e la microdeposizione di
gocce di oligonucleotidi sul supporto; si può raggiungere una densità
di 100.000 oligonucleotidi/per vetrino (da 20 a 60 basi).
Offrono vantaggi rispetto ai microarray e ai macroarray perché
sono in grado di svelare SNPs e di distinguere quindi tra sequenze
molto simili tra loro
DNA Chips o microarrays di oligonucleotidi: metodo sviluppato dalla
Affymetrix Inc.
Il sistema della sintesi diretta degli oligonucleotidi sul chip è stato sviluppato dalla Affymetrix Inc.:
Gli oligonucleotidi sono sintetizzati in situ sul substrato in posizioni definite. Funziona con migliaia di
transistor in un singolo circuito integrato per produrre serie ordinate di oligo -> i Gene Chips che
hanno dimensioni di un francobollo (1,6 cm2) con una densità di circa 106 oligo per cm2. Le sequenze di
un set di oligonucleotidi di DNA lunghi fino a 25 basi sono determinate in base all’esperimento.
Un algoritmo di calcolo disegna delle maschere litografiche da utilizzare per sintetizzare la serie di
oligo sui chips. Gli array sono costruiti in base ad un procedimento chimico diretto dalla luce
(http://affymetrix.com)
Fonte luminosa
MASCHERA
LITOGRAFICA
SUPPORTO
Metodo della Affymetrix
Fonte luminosa
MASCHERA
LITOGRAFICA
SUPPORTO
Luce -> DEPROTEZIONE
MASCHERA
LITOGRAFICA
Nuovo gruppo di
protezione fotolabile
Accoppiamento
chimico T-
SUBSTRATO
Luce -> DEPROTEZIONE
MASCHERA
LITOGRAFICA
C-
SUBSTRATO
Il procedimento è
ripetuto
Un nuovo approccio per i microarray di nucleotidi viene dalla tecnologia delle
fibre ottiche, è possibile creare 50000 pozzetti all’estremità di una fibra
ottica di 1 mm di diametro. 50000 per linea ognuna con un diverso
oligonucleotide possono essere messe in questi pozzetti e usate per sondare
un campione bersaglio, SNP o pattern di espressione genica.
Gli strumenti correnti usano 96 fibre ottiche e quindi si
possono analizzare contemporaneamente più di 5.000.000
di situazioni diverse ad ogni esperimento
Esempio di microarray di oligonucleotidi per analisi
differenziale dei trascritti tra popolazioni cellulari differenti
1 cm
Supporto
in
vetro, silicio o
fibre ottiche
cDNAottenuto da
RNA da tessuto
sano
cDNA ottenuto
da RNA da
tessuto tumorale
Segnale VERDE se un gene è espresso per esempio solo nel
tessuto sano, ROSSO se un gene è espresso solo nel tessuto
tumorale e diverse gradazioni di GIALLO (rosso + verde) se un
gene è espresso in entrambi i tessuti.
Uso di un microarray di oligonucleotidi per identificare SNPs
Il gene BRCA1 è coivolto nello sviluppo del tumore al seno e alle ovaie
Nel 1994 è stato clonato il gene BRCA1, un gene oncosoppressore situato sul cromosoma 17
Una serie di mutazioni in questo gene sono state riscontrate prevalentemente in soggetti
affetti da carcinoma mammario od ovarico, di tipo familiare
Il BRCA1 risulta essere implicato in una serie di funzioni cellulari di primaria importanza come la
riparazione del DNA, la regolazione della trascrizione, il controllo del ciclo cellulare e
l’ubiquitinazione
Nei soggetti portatori di questo tipo di mutazione il rischio di sviluppare un carcinoma mammario
nell’arco della vita è compreso tra il 50 e l’85%; per il carcinoma ovarico il rischio è del 15-60%
Le mutazioni identificate sono più di 600 e quasi tutte comportano la produzione di una proteina
tronca alcune di esse sono più frequenti di altre all’interno di una popolazione
Una donna su 500-800 è portatrice di una mutazione del BRCA1. È stato messo a
punto un test di screening per identificare mutazioni (SNPs) in qualsiasi posizione
del gene, anche se al momento molto costoso.
Analisi per ASO multipla su larga scala per identificare SNPs nel gene BRCA
1
La regione BRCA 1 codificante è lunga 5500 bp.
Per identificare una mutazione posta in una qualsiasi delle posizioni nella sequenza, si disegnano 4 ASO
di sequenza identica per OGNI POSIZIONE NUCLEOTIDICA -> 22000 oligonucleotidi in tutto
Gli oligo così ottenuti sono fissati ad un supporto, in modo permanente -> MICROARRAY
Analisi per ASO multipla su larga scala per identificare SNPs nel gene BRCA
1
La regione BRCA 1 codificante è lunga 5500 bp.
Per identificare una mutazione posta in una qualsiasi delle posizioni nella sequenza, si disegnano 4 ASO
di sequenza identica per OGNI POSIZIONE NUCLEOTIDICA -> 22000 oligonucleotidi in tutto
Gli oligo così ottenuti sono fissati ad un supporto, in modo permanente -> MICROARRAY
Le sonde (gli oligonucleotidi) sono attaccate al supporto e costituiscono il microarray ed è il DNA da
saggiare ad essere marcato.
1.
Si amplifica il DNA dal soggetto in esame mediante PCR
2.
Si marca l’amplificato con un colorante fluorescente
3.
Si ibrida al microarray, usando condizioni che permettono l’ibridazione di piccole sequenze (gli oligo)
perfettamente complementari
4.
Si analizza il risultato dell’ibridazione mediante analisi computerizzata per identificare eventuali
differenze rispetto ad un campione amplificato da un individuo omozigote per l’allele normale del
gene BRCA 1
Confronto di due microarray tra la posizione 2420 e 2440 del gene
BRCA 1 con DNA da individui con genotipo che differisce per un
singolo nucleotide in posizione 2431
Individuo OMOZIGOTE per l’allele normale di BRCA 1
T
G
C
A
C
2420
A
G
T
A
T
T
T
C
A
T
T
G
G
T
A
C
C
T
G
G
2440
Il DNA AMPLIFICATO e MARCATO ottenuto, può essere complementare con tutte le sue basi SOLO ad un ASO
presente in ogni colonna del microarray.
Individuo ETEROZIGOTE per l’allele normale di BRCA 1 e un allele con SNP in posizione 2430
T
G
C
A
C
2420
A
G
T
A
T
T
T
C
A
T
C
T
G
G
T
A
C
C
T
G
G
2440