Zebrafish as a model system
Organogenesis advenced in 24h
Rapid development
In situ hybridization
Large clutches of embryos per
mating,
which
are
transparent
throughout external development
RNA or antisense oligos microinjection
Mutagenesis screeninig
Analisi dell’espressione e della
funzione del gene dinamina1
(dnm1) durante lo sviluppo
embrionale di zebrafish
(Danio rerio)
Endocitosi
• Processo cellulare che permette alle cellule di assumere molecole di
diversa natura dall’ambiente esterno, mediante movimenti della membrana
• può essere costitutiva o regolata da stimoli esterni (ligandi, virus….)
• classificazione sulla base della dimensione delle vescicole endocitotiche,
sulla natura delle molecole internalizzate (ligandi, recettori, lipidi) e sulle
modalità di formazione delle vescicole
Endocitosi mediata da clatrina
Modalità di trasporto
vescicolare implicata
nella comunicazione
intercellulare, nel
recupero dei
neurotrasmettitori a
livello del terminale
pre-sinaptico,
nell’internalizzazione
di recettori, fattori
di crescita, antigeni e
nutrienti
Endocitosi mediata da clatrina
• Lo stimolo elettrico arriva al
terminale sinaptico
• Influsso di Ca2+
• esocitosi
• endocitosi mediata da clatrina
In Drosophila melanogaster sono
stati
isolati
mutanti
temperatura sensibili del gene
dnm1. A temperature non
permissive si ha un fenotipo
paralitico a causa del mancato
recupero di neurotrasmettitori
La famiglia delle dinamine (dnm)
Invertebrati
• Drosophila melanogaster (shibire)
• C. elegans (dyn1)
Vertebrati
• Mus musculus (dnm1, dnm2, dnm3)
• Rattus norvegicus (dnm1, dnm2, dnm3)
• Homo sapiens (dnm1, dnm2, dnm3)
Identificazione del gene dnm1 di
zebrafish
• Screening di database di sequenze EST di zebrafish
STOP
1114 bp
1188 bp
5’UTR
h dnm1 67
ORF
1532
3’UTR
2661
• 5’ RACE
Abbiamo ottenuto un clone di circa 2700 bp codificante
per una proteina di 843 aminoacidi che presenta un’identità
dell’80% con la proteina umana DNM1.
Geni dnm di zebrafish
hDNM1 hDNM2 hDNM3
zDNM1
87%
76%
78%
zDNM2a
77%
85%
78%
zDNM2b
75%
82%
77%
zDNM3
72%
74%
75%
nucleo
30s
5’UTR
AUG
Il termine '''espressione genica''' indica il
processo attraverso cui l'informazione
contenuta in un gene viene convertita in una
proteina
3’UTR
AAAA
proteina
50s
mRNA
Espressione genica
• Equivalenza nucleare: i nuclei di tutte le cellule di un organismo hanno lo stesso
contenuto in termini di geni
• L’espressione di un gene può essere costitutiva o regolata nello spazio e nel
tempo
Cellula muscolare
Cellula nervosa
gene1
gene1
gene2
gene2
gene3
mRNA 1
gene3
mRNA 2
AAAA
mRNA 3
mRNA 1
AAAA
mRNA 2
RT-PCR
ESTRAZIONE
DELL’mRNA
RETROTRASCRIZIONE
cDNA1
cDNA2
PCR
cDNA3
cDNA1
cDNA2
IBRIDAZIONE IN SITU
ANALISI FUNZIONALE
ANALISI FUNZIONALE PER PERDITA DI FUNZIONE
Si inietta uno specifico morfolino, un oligonucleotide antisenso che si
appaia al trascritto del gene target bloccando la traduzione.
ANALISI FUNZIONALE
ANALISI FUNZIONALE PER GUADAGNO DI FUNZIONE
RNA sintetizzato in vitro sulla regione
codificante del gene d’interesse
AUG
AA
pcs2+ vector
• si testano diverse concentrazioni di morfolino o di RNA
• vengono coiniettati traccianti vitali o RNA codificante per la proteina
GFP allo scopo di verificare l’avvenuta iniezione
• la microinezione viene eseguita nel tuorlo di embrioni fino allo stadio di 4
blastomeri
• controlli: -embrioni non iniettati
-per morfolino si può usare morfolino STANDARD CONTROL
allo scopo di dimostrare che i fenotipi osservati nei morfanti
non siano dovuti alla microiniezione in sé.
Sinapsi neuromuscolare
SNC
somite
NT
SNC
somite
NT
somite
(Panzer et al., 2005)
Primary motor neuron axons CaP (pink), MiP (blue), and RoP (green) exit the spinal cord
through the ventral root and extend along the common pathway to the choice point
(asterisk) located at the horizontal myoseptum as shown in the left myotomal segment.
At the choice point, axons pause and then proceed to innervate a cell-appropriate
territory. At later time points, MiP retracts its ventral axon, the dorsal MiP and ventral
CaP axons reach the edge of the myotome and turn laterally, and RoP elaborates an
axonal arbor laterally near the horizontal myoseptum as shown in the right myotomal
segment. Beginning ca. 5 h after primary motor axons pioneer the common pathway,
secondary motor axons (dark blue) exit the spinal cord and extend into the periphery as
shown in the right myotomal segment
A) defects in
the activity of
neuromuscolar
synapses
SNC
C
somite
B) defects in
the axons
pathfinding
Motility
defects
Muscular
defects
SNC
C
somite
Touch response defects
1. mutants with defects in the function of
synaptic proteins involved in the control of
synapse activity (acetylcholinesterase,
acetylcholine receptor....)
2 mutants with defects in neuromuscular
synaptogenesis
Hp: the loss of function of zdnm1 could limit the
formation or the activity of CNS synapses and
neuromuscolar synapses.
synapse activity
We are analysing by electron microscopy the central nervous system of
morphants, focusing on the number of synapses and the ultrastructure of
presynaptic terminal.
PSD
PSD
ctrl
dnm1-MO
Lower Dnm1 protein level after zdnm1-MO microinjection could limit
neurotransmitters uptake decreasing endocytosis at presynaptic level.
semi-thin sections
thin sections
(24 hpf, 48 hpf, 63 hpf, 90
hpf)
(24 hpf, 48 hpf, 63 hpf, 90
hpf)
histological and
cytological analysis
of somite structure
motility defects
mutants with defects in the function of
synaptic proteins involved in the control of
synapse activity (acetylcholinesterase,
acetylcholine receptor....)
Defects in myofibrils
organisation
nerve input works to
refine the parameters
that determine functional
specialisation
of
the
muscle.
Hp: the loss of function of zdnm1, could cause an
impairment of nerve input that affects the myofibrils
organisation
conclusions
• zdnm1 presents a temporally and spatially
regulated
expression
pattern
during
zebrafish
central
nervous
system
development.
• the effects of zdnm1 knock down on
motility and myofibrils organization in
somite cells strongly suggest an important
role of zDnm1 in formation and activity of
neuromuscular synapses and synapses in
central nervous system.
(Berghmans et al., 2005)
(Berghmans et al., 2005)
(Berghmans et al., 2005)
muscle cells development
PCR
5’
3’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
• Metodica messa a punto
da Kary Mullis (premio
Nobel per la chimica,1993)
• Permette di amplificare
una SPECIFICA sequenza di
DNA
• Primer: oligonucleotidi con
polarità 5’-3’ che
fiancheggiano la sequenza
che si vuole amplificare.
Servono da innesco per la
reazione di polimerizzazione
catalizzata dalla Taq
polimerasi
• Taq polimerasi: DNA
polimerasi resistente al
calore
RT-PCR
Retrotrascrizione
PCR