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Identificazione dei geni
responsabili di patologie
ereditarie
Perchè è importante identificare i
geni associati a patologie umane?
• Conoscere il gene vuol dire avere uno strumento per
la diagnosi molecolare della malattia. Importante
soprattutto per la diagnostica prenatale e per la
consulenza genetica.
• La conoscenza del gene è fondamentale per capire i
meccanismi molecolari della malattia e per elaborare
modelli sperimentali che consentano di studiarla più
facilmente.
• La conoscenza dei geni-malattia è importante per
elaborare strategie terapeutiche mirate, sia di tipo
tradizionale, sia di terapia genica.
Come si possono identificare i geni
responsabili di patologie nell’uomo?
• Clonaggio funzionale
• Clonaggio posizionale
• Approccio del gene candidato
indipendente dalla posizione genomica
• Approccio del candidato posizionale
Approcci di clonaggio funzionale
1. Identificazione e purificazione della
proteina responsabile. Sequenziamento
di peptidi. Identificazione del gene
basata sulla sequenza dei peptidi.
2. Clonaggio per complementazione
Clonaggio del gene a seguito di isolamento della proteina:
Identificazione del gene dell’emofilia A (fattore VIII)
Purificazione con tecniche
biochimiche tradizionali
Microsequenza
AGGFLMKMFGGHTSREDFCH
AHHTFIAAVEQLWDYGMATT
FGKRMLKFSSCHTRDEGGAK
Sequenze possibili
N
C
C
CAU UAU
His
Tyr Phe
CAC UAU
5’
C
UUU
UUC
A
C
A
G
C
AUU GCU
Ile
A
C
G
GCU
Ala Ala
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A
C
G
A
GUU GAG
A
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A
C
C G
UUU
C
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C
UAU
A
C
G
GGU
C
AUG
Val Glu Gln Leu Trp Asp Tyr Gly Met
GUC GAA
CAG
CUG
UGG GAU
mRNA
Sequenza effettiva
UAC
GGU
AUG
3’
Ibridazione di cDNA library
con oligonucleotidi degenerati
5’
C
C
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His
C
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Tyr Phe
A
C
A
G
C
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TGGGACTATGGTATG
TGGGATTACGGTATG
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C
G
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C
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A
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3’
AUG
Val Glu Gln Leu Trp Asp Tyr Gly Met
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TGGGACTATGGGATG
TGGGATTACGGGATG
TGGGACTACGGGATG
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TGGGACTATGGCATG
TGGGATTACGGCATG
TGGGACTACGGCATG
TGGGATTATGGAATG
TGGGACTATGGAATG
TGGGATTACGGAATG
TGGGACTACGGAATG
--------CACTATTTCATCGCAGCGGTCGAACAGCTGTGGGATTACGGTATG------------------GTGATAAAGTAGCGTCGCCAGCTTGTCGACACCCTAATGCCATAC-------------
Ibridazione di cDNA library
con oligonucleotidi degenerati
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TGGGACTACGGTATG
TGGGATTATGGGATG
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TGGGATTACGGGATG
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TGGGATTACGGAATG
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--------GTGATAAAGTAGCGTCGCCAGCTTGTCGACACCCTAATGCCATAC-------------
Ibridazione di cDNA library
con oligonucleotidi degenerati
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PCR con oligonucleotidi degenerati
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AUG
Val Glu Gln Leu Trp Asp Tyr Gly Met
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CUG
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AUG
3’
A
C C C C
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5’--------CACTATTTCATCGCAGCGGTCGAACAGCTGTGGGATTACGGTATG-----------3’
3’--------GTGATAAAGTAGCGTCGCCAGCTTGTCGACACCCTAATGCCATAC-----------5’-3’ACCCTAATACCATAC 5’
G G C
G
T
PCR con oligonucleotidi degenerati
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M
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P
Q
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Esempio di clonaggio per complementazione:
Anemia di Fanconi
• Sindrome autosomica recessiva
• Anemia prograssiva, pancitopenia
• Difetto di riparazione del DNA
• Anomala sensibilità alle radiazioni ionizzanti e
ai chemioterapici
Saggio funzionale
Radiazioni ionizzanti
Linea cellulare da paziente
Cellule morte
Linea cellulare normale
Cellule vive
Screening funzionale
Vettore plasmidico
cDNA normale
Linea cellulare da paziente
cDNA library da soggetto normale
Radiazioni
Cellule trasfettate
con library
Analisi del plasmide
Clone
Altro esempio di clonaggio funzionale:
identificazione di oncogeni cellulari
Cellule tumorali
Le cellule trasformate sono in grado
di crescere in particolari condizioni,
come terreni di coltura senza siero, e
formano colonie isolabili
cDNA library in vettore
di espressione
Cellule normali
Purificando e sequenziando il DNA
plasmidico presente nelle colonie
trasformate si possono identificare gli
oncogeni
Cellula trasformata