Definizione di genoteca (o library) di DNA Collezione completa di frammenti di DNA, inseriti singolarmente in un vettore di clonaggio. Possono essere di DNA genomico o di cDNA. Le genoteche o librerie di DNA: –Libreria genomica: collezione di cloni che include tutto il DNA genomico di una certa specie (es. il genoma umano aploide contiene circa 3x109 coppie di basi, che possono essere contenute in circa 1.5x105 cloni di 20 kb ciascuno) –Libreria di cDNA: collezione di cloni che include tutte le specie di mRNA (trascritte in cDNA) espresse in un dato tessuto, incluso quelle piu’ rare Costruzione di librerie genomiche Costruzione di librerie di cDNA Materiale di partenza: cDNA libraries Oligo-dT priming RT First DNA strand 3’ TTTTTTTT 5’ 5’ AAAAAAAA 3’ mRNA Random priming First DNA strand RT RT 5’ 5’ AAAAAAAA 3’ 5’ mRNA Materiale di partenza: cDNA libraries Sintesi del secondo filamento 3’ 5’ First DNA strand TTTTTTTT 5’ AAAAAAAA 3’ mRNA RNAsi H + DNA polimerasi I TTTTTTTT 5’ AAAAAAAA 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ pH alcalino TTTTTTTT 5’ AAAAAAAA 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ DNA polimerasi + ligasi First DNA strand TTTTTTTT 5’ AAAAAAAA 3’ Second DNA strand Materiale di partenza: cDNA libraries Sintesi del secondo filamento 3’ First DNA strand 5’ TTTTTTTT 5’ AAAAAAAA 3’ mRNA RNAsi + DNA polimerasi Loop Second DNA strand AAAAAAAA 3’ TTTTTTTT 5’ Nucleasi S1 + DNA polimerasi Second DNA strand 5’ 3’ AAAAAAAA 3’ TTTTTTTT 5’ First DNA strand La sintesi del cDNA produce, a partire da molecole di messaggero uguali, molecole di DNA di diversa lunghezza. Sovrarappresentazione del 3’ se la sintesi è innescata da oligo-dT cDNA-1 (full-lenght) 3’ 5’ TTTTTTTT 5’ AAAAAAAA 3’ mRNA cDNA-2 3’ 5’ 3’ cDNA-3 5’ 3’ 5’ cDNA-4 TTTTTTTT 5’ AAAAAAAA 3’ TTTTTTTT 5’ AAAAAAAA 3’ TTTTTTTT 5’ AAAAAAAA 3’ Vettori plasmidici Vettori fagici Vettori fagici Left Ligasi Concatameri Right Il cDNA può essere clonato direzionalmente EcoRI TTTTTTTTGAATTC 5’ AAAAAAAA 3’ 3’ 5’ mRNA dCTP + transferasi terminale TTTTTTTTGAATTC 5’ AAAAAAAA 3’ 3’CCCCCC 5’ RNAsi o pH alcalino TTTTTTTTGAATTC 5’ 3’CCCCCC 5’AAGCTTGGGGGG 3’ Hind III 3’TTCGAACCCCCC 5’AAGCTTGGGGGG Hind III DNA polimerasi TTTTTTTTGAATTC 5’ AAAAAAAACTTAAG 5’ EcoRI Ospiti Batteri Virus (Batteriofagi) Colonie Placche di lisi Screening di una library, ossia come trovare un ago in un pagliaio Screening di una library, ossia come trovare un ago in un pagliaio Screening di una genoteca, ossia come trovare un ago in un pagliaio Analisi dei cloni ottenuti • Crescita dei cloni, purificazione del DNA plasmidico o fagico e analisi con enzimi di restrizione • Sequenziamento • Sottoclonaggio Walking cromosomico Identificare tutta la sequenza di un gene (o di un mRNA) a partire da un frammento parziale iniziale Sonda 3 Sonda 1 Sonda 2 Sonda 4 Gene A B C E D G F Sequenziamento enzimatico del DNA (Sanger) T G C A 5’ 3’ TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 3’ 5’ 5’ 3’ TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 3’ 5’ 5’ 3’ TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 3’ 5’ 5’ 3’ TTACGTAACGTCA 5’ 3’ TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT 5’ 3’ TTACGTAACGTCA AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 3’ 5’ 5’ 3’ TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT 5’ 3’ TTACGTAACGTCA AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 3’ 5’ dA dC dG dT + DNA Polimerasi 5’ 3’ TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT 5’ 3’ TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 3’ 5’ 5’ 3’ TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT 5’ 3’ TTACGTAACGTCA AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 3’ 5’ dA dC dG dT + DNA Polimerasi ddA ddC ddG ddT TTACGTAACGTCAG 14 AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA TTACGTAACGTCAGA 15 AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA TTACGTAACGTCAGAA 16 AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA TTACGTAACGTCAGAAC 17 AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA TTACGTAACGTCAGAACG 18 AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA TTACGTAACGTCAGAACGT 19 AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA TTACGTAACGTCAGAACGTC 20 AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA Elettroforesi - Laser Fluorimetro + A C G T Elettroforesi Lettura G Laser Fluorimetro + A C G T Elettroforesi Lettura GAAC Laser Fluorimetro + Elettroferogramma Esempio di clonaggio di un gene Clonaggio del gene a seguito di isolamento della proteina: Identificazione del gene dell’emofilia A (fattore VIII) Gene: 150000 basi mRNA: 7000 basi Proteina: 2351 a.a. Purificazione del fattore VIII di maiale con tecniche biochimiche tradizionali Microsequenza AGGFLMKMFGGHTSREDFCH AHHTFIAAVEQLWDYGMATT FGKRMLKFSSCHTRDEGGAK Sequenze possibili N C C CAU UAU His Tyr Phe CAC UAU 5’ C UUU UUC A C A G C AUU GCU Ile A C G GCU Ala Ala AUC GCA GCG A C G A GUU GAG A CAG A C C G UUU C UGG GAU C UAU A C G GGU C AUG Val Glu Gln Leu Trp Asp Tyr Gly Met GUC GAA CAG CUG UGG GAU mRNA-maiale Sequenza effettiva UAC GGU AUG 3’ Ibridazione di cDNA library di fegato di maiale con un oligonucleotide degenerato 5’ C C CAU UAU His C UUU Tyr Phe A C A G C AUU GCU Ile TGGGATTATGGTATG TGGGACTATGGTATG TGGGATTACGGTATG TGGGACTACGGTATG A C G GCU Ala Ala A C G A GUU GAG A CAG A C C G UUU C UGG GAU C UAU A C G GGU 3’ AUG Val Glu Gln Leu Trp Asp Tyr Gly Met TGGGATTATGGGATG TGGGACTATGGGATG TGGGATTACGGGATG TGGGACTACGGGATG TGGGATTATGGCATG TGGGACTATGGCATG TGGGATTACGGCATG TGGGACTACGGCATG TGGGATTATGGAATG TGGGACTATGGAATG TGGGATTACGGAATG TGGGACTACGGAATG --------CACTATTTCATCGCAGCGGTCGAACAGCTGTGGGATTACGGTATG------------------GTGATAAAGTAGCGTCGCCAGCTTGTCGACACCCTAATGCCATAC------------- Ibridazione di cDNA library di fegato di maiale con un oligonucleotide degenerato TGGGATTATGGTATG TGGGACTATGGTATG TGGGATTACGGTATG TGGGACTACGGTATG TGGGATTATGGGATG TGGGACTATGGGATG TGGGATTACGGGATG TGGGACTACGGGATG TGGGATTATGGCATG TGGGACTATGGCATG TGGGATTACGGCATG TGGGACTACGGCATG TGGGATTATGGAATG TGGGACTATGGAATG TGGGATTACGGAATG TGGGACTACGGAATG --------CACTATTTCATCGCAGCGGTCGAACAGCTGTGGGATTACGGTATG----------- --------GTGATAAAGTAGCGTCGCCAGCTTGTCGACACCCTAATGCCATAC------------- Ibridazione di cDNA library di fegato di maiale con un oligonucleotide degenerato TGGGATTATGGTATG TGGGACTATGGTATG TGGGACTACGGTATG TGGGATTATGGGATG TGGGACTATGGGATG TGGGATTACGGGATG TGGGACTACGGGATG TGGGATTATGGCATG TGGGACTATGGCATG TGGGATTACGGCATG TGGGACTACGGCATG TGGGATTATGGAATG TGGGACTATGGAATG TGGGATTACGGAATG TGGGACTACGGAATG --------CACTATTTCATCGCAGCGGTCGAACAGCTGTGGGATTACGGTATG----------- TGGGATTACGGTATG --------GTGATAAAGTAGCGTCGCCAGCTTGTCGACACCCTAATGCCATAC------------- Clone di cDNA di maiale gagtgcagccaacccgccctgatgaagatgaagcacgtgagcagctttgtccagaagtat E C S Q P A L M K M K H V S S F V Q K Y tccgacaccatagccgagttgcgggagctgcagccgtcggcgagagacttcgaagttcga S D T I A E L R E L Q P S A R D F E V R agccttgtgggctgtggtcacttcgctgaacactatttcatcgcagcggtcgaacagctg S L V G C G H F A E H Y F I A A V E Q L tgggattacggtatgaaaatcatgaagaagaaggctttgctggcccaggaacaggtttca W D Y G M K I M K K K A L L A Q E Q V S tttttcgaggaggagaggaacatattatctcggagcacgagtccttggatcccccagtta F F E E E R N I L S R S T S P W I P Q L Per trovare il gene umano, library genomica o di cDNA? Sonda Human: 269 atgacacctcaacccagtggtccaaaaacatgaaacatttgaccccgagcaccctcacac 328 ||||||| |||||||||||||||||||||||||| Pig: ||||| ||| | | |||||||||| 4022 atgacacttcaacccagtggtccaaaaacatgaactatttggcccagggaaccctcacac 4081 Human: 329 agatagactacaatgagaaggagaaaggggccattactcagtctcccttatcagattg 386 ||||||| || |||||||| || ||| |||||||||||||||| ||| |||||||||| Pig: 4082 agatagagtataatgagaaagaaaaaagggccattactcagtcccccctatcagattg 4139 Screening di una cDNA library umana con la sonda di maiale (ibridizzazione a bassa stringenza) mRNA a b c f d e cDNA consensus umano Screening di library genomiche umane con sonde di cDNA umano mRNA f c Library genomica fago l Library genomica BAC
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