Lezione 2-3
13/X/06
Cosa dobbiamo sapere
La doppia elica: orientamento dei due filamenti 5’-3’ DNA pol
i cromatidi da cosa sono costituiti ?
quale è il verso di trascrizione della RNA pol II
“coding strand”* = filamento trascritto = mRNA
* non è il templato
cDNA (DNA complementare al messaggero)
da distinguere dalla Coding Sequence a volte confusa col cDNA
La sequenza codificante corrisponde all’ RNA messaggero
contiene i codoni che vengono tradotti
Trascrizione e complemetarietà
In banca dati la sequenza di un gene è indicata nel verso
di trascrizione e corrisponde alla coding sequence
che è uguale al messaggero (salvo T
U)
Le sequenze per convenzione si scricvono sempre 5’3’
salvo quando si mostra una doppia elica in cui c’è la
complementare che è antiparallela
Trascrizione orientamento e verso
La sequenza “coding” non è il templato
S
B
A
G
L
I
A
T
O
Quale strand è trascritto? che
verso ha ?
Rna polimerasi II
DNA templato della trascrizione
Tutte le pol sintetizzani 5’-3’ su un templato 3’- 5’ antiparallelo
schema giusto
Cosa è un Southern blot
DNA digerito con enzimi di restrizione
- trasferito su filtro
- Ibridato con una sonda marcata di DNA a doppio filamento
denaturato o con singolo filamento
Studio di mappe di restrizione genomiche per individuare i
frammenti di restrizione che contengono una data porzione di
DNA o un frammento di un gene,
Studio di un gene a partire da un cDNA
Gel BrEt x Southern
Foto Southern
A: Genomic P1 clone (0.3 ug) and B: human genomic DNA (10 ug) were digested with EcoRI (E),
BamHI (B), HindIII (H) and PstI (P). The digested samples were separated on a 1% agarose TBE
gel, blotted and hybridized with a PEDF cDNA probe. A 1 kb ladder is given to show relative sizes
of the hybridizing bands. The figure shows similarities in restriction pattern between the genomic
DNA and the P1 clone.
Cosa si analizza con un
Northern blot
La trascrizione cellulare
Foto Northern (lattato deidrogenasi)
Le sonde (probes)
Sonde a DNA doppio o singolo filamento anche ad RNA**
Plasmidi con promotore di trascrizione Sp6**
Sonde clonate o amplificate
Sonde marcate (32 P) o fluorescenti
Southern o Northern tipi di sonde uguali
Per Northern uso di sequenze trascritte
Dall’espressione al genoma
e viceversa
Con le sonde dei cDNA
al genoma
(mappa e regioni non trascritte)
Con le sonde genomiche
ricerca di geni
Uso dei marcatori
Ricerche di tutte le sequenze trascritte come marcatori
Da sequenze ripetute mappature cromosomiche
Struttura e regolazione dei geni
Perché i geni sono regolati
Meccanismi di regolazione dei geni
Differenze tra procarioti ed eucarioti
Differenti strutture regolative analizzate con geni reporter e
utilizzate all’interno di plasmidi
e vettori per espressione
Dovete sapere come è strutturato un gene, differenze tra
procarioti ed eucarioti, geni costitutivi e “house keeping”,
geni inducibili, regolati e tessuto specifici. (corso di bio molec.)
Che vuol dire clonare a che
serve come si fa
I cloni in microbiologia o genetica dei microoranismi
I colonia (clone) deriva dalle mitosi di una singola cellula
e contiene qualche centinaio di migliaia di cellule
Cloni di cellule eucariotiche
Esperimenti olistici
(≠ progr. euristici autoincr.)
Phenotypic alteration of eukaryotic cells using
randomized libraries of artificial transcription factors
Nature Biotechnology 21, 1208 - 1214 (2003)
Published online: 7 September 2003; | doi:10.1038/nbt868
Kyung-Soon Park1, 2, Dong-ki Lee1, 2, Horim Lee1, Yangsoon Lee1, Young-Soon Jang1,
Yong Ha Kim1, Hyo-Young Yang1, Sung-Il Lee1, Wongi Seol1 & Jin-Soo Kim1
Correspondence should be addressed to Jin-Soo Kim [email protected]
We have developed a method in which randomized libraries of zinc
finger−containing artificial transcription factors are used to induce phenotypic
variations in yeast and mammalian cells. By linking multiple zinc-finger domains
together, we constructed more than 100,000 zinc-finger proteins with diverse DNAbinding specificities and fused each of them to either a transcription activation or
repression domain. The resulting transcriptional regulatory proteins were
expressed individually in cells, and the transfected cells were screened for various
phenotypic changes, such as drug resistance, thermotolerance or osmotolerance in
yeast, and differentiation in mammalian cells. Genes associated with the selected
phenotypes were also identified. Our results show that randomized libraries of
artificial transcription factors are useful tools for functional genomics and
phenotypic engineering.
Clonaggio come manipolazione di
DNA
Clonaggio : plasmidi
enzimi di restrizione
Clonaggio perché i cloni sono isogenici e se contengono un
plasmide si moltiplica con le cellule
Le cellule trasfettate col plasmide si clonano
Strategia e metodo di clonaggio
Extraction of Viral RNA and
Conversion to DNA
Reverse Transcription
RNA
DNA
Cloning a Gene into a Plasmid
Amplificazione tramite PCR
PCR
clonaggio
Cloning
Gene
codificante
DNA
encoding
di interesse
gene of interest
pl di
plasmid
Plasmide
espressione
Growth and Purification of
Plasmids
trasfezione
Transfection
estrazione del DNA
Extraction
crescita batterica
col plasmide
Plasmid growth
tramite selezione
in bacteria
Purification of
Purificazione
plasmid
del
plasmide
Recombinant DNA Technology and
Vaccine Development
produzione dell’antigene
In vitro
In
vitro antigen
production
Cellule
eucariotiche
CHO, yeast,
or insect cells
vettore
Vaccine vector
col vaccino
Produzione
In vivo dell’antigene in
vivoantigen
production