Clonaggio per espressione e clonaggio funzionale
Clonare un gene sfruttando il metodo tradizionale
dell’ibridazione degli acidi nucleici è possibile solo quando
si ha qualche idea sulla sequenza che si sta cercando.
Tuttavia capita molto spesso di essere interessati a geni per
i quali non si ha nessuna indicazione sulla sequenza, ma si
hanno a disposizione informazioni sulla proteina. Per
molte di queste situazioni sono state sviluppate diverse
strategie che, senza far ricoso all’ibridazione, permettono
di arrivare all’identificazione del cDNA in questione. In
genere queste strategie necessitano di libraries ci cDNA
prodotte in vettori di espressione. Questi ultimi possono
essere sia di tipo plasmidico che fagico.
cDNA
Expression Tag,
contenente il sito di
inizio della traduzione
(b-Gal o GST)
MCS
Promotore
regolabile
(ad es. lac)
cDNA
MCS
Problemi posti dalle libraries di espressione
• Il cDNA deve essere nella giusta cornice di lettura
rispetto all’expression tag utilizzato. Pertanto non tutti i
cloni che contengono l’inserto produrranno la proteina
corretta
• Le proteine prodotte sono raramente intere. E’
estremamente più facile trovarsi di fronte a frammenti.
Tuttavia questo in genere non dà molto fastidio perché i
domini funzionali responsabili della caratteristica che
interessa sono unità abbastanza indipendenti
• Se si usano vettori procariotici per proteine eucariotiche,
la conformazione tridimensionale delle proteine di fusione
potrebbe non essere corretta, e quindi lo screening
potrabbe rivelarsi inefficace
Situazioni tipiche e strategie di screening
Problema 1
Ho prodotto un anticorpo che riconosce una proteina dalle
proprietà molto interessanti. Non riesco a purificare
biochimicamente la proteina. Ciononostante ne voglio
isolare il cDNA.
Soluzione
Posso effettuare lo screening di una library di espressione,
utilizzando come sonda specifica il mio anticorpo, marcato
con isotopi radioattivi o altri traccianti.
+
Induttore del
promotore
Proteine
Proteine
* *
* *
*
Legame antigene-anticorpo,
seguito da lavaggi
Situazioni tipiche e strategie di screening
Problema 2
Sto studiando una proteina, e so che nelle cellule esiste
sotto forma di complesso con altre proteine. Voglio trovare
i cDNA delle altre proteine che fanno parte di questo
complesso.
Soluzione
Procedo come per l’anticorpo, se sono in grado di
produrre notevoli quantità della proteina già nota,
opportunamente marcata
Situazioni tipiche e strategie di screening
Problema 3
So che una certa sequenza di DNA a doppio filamento lega
una proteina importante per la regolazione trascrizionale
del promotore di un gene. Voglio clonare il cDNA che
codifica per questa proteina.
Soluzione
Posso effettuare lo screening di una library di espressione,
utilizzando come sonda specifica un oligonucleotide a
doppio filamento, tipicamente marcato con 32P
Situazioni tipiche e strategie di screening
Problema 4
Voglio identificare i possibili substrati di un certo enzima
(ad esempio potrebbe essere una protein-chinasi)
Soluzione
Se possiedo l’enzima purificato, posso effettuare lo
screening di una library di espressione, utilizzando
l’enzima per trasferire sui substrati specifici una sostanza
tracciante (relativamente semplice nel caso delle chinasi,
con le quali posso utilizzare 32P-g-ATP)
Clonaggio funzionale
In molti casi ci si trova di fronte al problema di voler
identificare i geni responsabili di determinate attività
biologiche, senza alcuna indicazione sulle molecole che
possono legare la proteina di interesse. In questo caso è
importante avere a disposizione un saggio funzionale, che
permetta di identificare il DNA in questione in base alla
sua attività.
Ad esempio, è
relativamente facile
clonare i geni coinvolti
in funzioni vitali di
microorganismi se si
hanno a disposizione
mutanti condizionali
Oltre che per clonare geni, i saggi funzionali in mutanti
condizionali possono anche essere utilizzati per rispondere
a precisi quesiti biochimici
Esempio di clonaggio funzionale:
identificazione di oncogeni cellulari
Cellule tumorali
Le cellule trasformate sono in grado
di crescere in particolari condizioni,
come terreni di coltura senza siero, e
formano colonie isolabili
CMV
cDNA library in vettore
di espressione
Cellule normali
Purificando e sequenziando il DNA
plasmidico presente nelle colonie
trasformate si possono identificare gli
oncogeni
Cellula trasformata
Saggio funzionale
Radiazioni ionizzanti
Linea cellulare da paziente
Cellule morte
Linea cellulare normale
Cellule vive
Screening funzionale
Vettore plasmidico
cDNA normale
Linea cellulare da paziente
cDNA library da soggetto normale
Radiazioni
Cellule trasfettate
con library
Analisi del plasmide
Clone
Screening in saggi funzionali di libraries suddivise in pool
Library genomica o di cDNA
Purificazione DNA plasmidico da
tutti i singoli cloni
I DNA vengono raggruppati per
formare diverse serie di pool
Singoli cloni
Prima serie
Seconda serie
ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVXY
Pool 1
Pool 2
Pool 7
Pool 3 Pool 4
Pool 5 Pool 6
Pool 8
Esempio: identificazione del gene dell’eritropoietina
Cellule CHO trasfettate
Pool 7
Cellule staminali midollo osseo
Terreno di
coltura
No eritrociti
Pool 8
Eritrociti
Pool 4
No eritrociti
Pool 5
Eritrociti
Pool 6
No eritrociti