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UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI TRIESTE
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FACOLTÀ DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI
Classe delle Lauree magistrali in Biologia LM/6
Corso di Laurea magistrale in Genomica Funzionale
EXPERIMENTAL THESIS
AN IN VIVO AAV-BASED FUNCTIONAL SELECTION
STRATEGY FOR THE IDENTIFICATION OF NOVEL
GENES PROMOTING CARDIAC PROTECTION
Laureanda
Francesca Bortolotti
Relatore
Prof. Guidalberto Manfioletti
Correlatori
Prof. Mauro Giacca
Dott.ssa Giulia Ruozi
Anno accademico 2010-11
I
SUMMARY
Despite the recent advances in cardiovascular surgery and therapy, cardiac diseases are still
the leading cause of mortality and morbidity in the developed countries. Current therapies are
only able to limit the progression of the disease and therefore new therapeutic and prevention
targets are urgently needed. Several approaches of gene therapy have been proposed recently
in order to deliver therapeutic molecules in vivo and in particular viral vectors based on adenoassociated viruses (AAV) appear as one of the most promising tool for gene transfer in post
mitotic tissues, such as heart and skeletal muscle. In fact, these vectors retain less then 10% of
the viral genome, permitting a long persistence in vivo without eliciting neither an
immunogenic nor an inflammatory response, and are able to transduce their target cells at high
multiplicity, thereby allowing the simultaneous delivery of various genes.
Recent work performed in the Molecular Medicine laboratory (ICGEB) has clearly
demonstrated the efficacy of AAV vectors to transduce ischemic tissue and deliver secreted
factors, such as Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), Angiopoietin-1 (Ang-1) and
others, which are able to induce revascularization and protection after damage.
Starting from this evidence, the overall purpose of the current project is to develop an
innovative selection procedure aiming at the identification of novel secreted factors involved
in protection from ischemic injuries. The selection strategy is based on in vivo gene transfer of
a library of secreted factors cloned into AAV vectors followed by a selection step, triggered by
an injury. This procedure is expected to lead to the identification of cDNAs coding for proteins
that gave a selective survival advantage to transduced over non-transduced cells. Theoretically,
the cells that were transduced with a considerable amount of the protective vector should
better survive to the insult and contain an enriched amount of the specific DNA sequence,
detectable by PCR. In case a single cycle of transduction-damage-DNA extraction would not
be sufficient to identify a clear enrichment in one or more protective factors, the viral cDNAs
extracted from the survived cells will be re-cloned in the AAV plasmid to produce a new set of
vectors carrying different proportions of the original genes. This new preparation will be used
for further rounds of in vivo selection until the identification of a clear enrichment of one or
more protective factors.
The work presented in this thesis is mainly focused on the selection strategy set up and on
the in vitro proof of principle of the feasibility of this approach. In addition, preliminary data
of the in vivo screening are included and discussed.
II
The first goal was the sub-cloning of a cDNA library of secreted factors in an AAV
backbone plasmid containing the CMV promoter, that allows transgene expression into
mammalian cells, and the viral inverted terminal repeats (ITRs), essential for viral genome
packaging. In order to achieve the simultaneous expression of gene combinations in vivo, we
have cloned more than 120 cDNAs in AAV and prepared 10 pools of AAV vectors for our
selection procedure. Since this innovative approach has never been tempted before, our first
efforts have aimed at showing that it is possible to obtain a pool of AAV vectors starting from
the corresponding pool of plasmids and that the ratio between the various cDNAs is
maintained in the two preparations. For this purpose, we specifically analyzed the packaging
efficiency and the expression level of each cDNA after in vivo delivery of various AAV pools,
investigating in particular possible bias due to the number of clones included in each pool and
the lengths of the cDNAs.
Then, we validated our innovative selection strategy in an in vitro model using a pool of
AAV vectors coding for 5 secreted factors and the green fluorescent protein as a reporter gene.
A mechanical selection of the transduced cells based on fluorescence-activated cell sorting led
to a significant enrichment of the GFP cDNA, demonstrating that is possible to select a cDNA
by the induction of a specific selecting pressure.
Finally, the innovative selection strategy was applied in vivo in two mouse models of
cardiovascular pathology (hind-limb ischemia and isoproterenol-induced cardiac damage).
Although still preliminary, these experiments allowed the identification of two candidate
protective genes, thereby supporting the screening of the entire library. The molecular
mechanisms underlying the protective activity of the newly identified factors are the matter of
current investigation both in vivo and in vitro.
III
RIASSUNTO
Negli ultimi anni l'attenzione della comunità medico scientifica si è focalizzata sempre di più
sulle patologie cardiovascolari di origine ischemica che sono diventate la principale causa di
morte nei paesi industrializzati. Le terapie odierne sono in grado solo di limitare la
progressione di queste patologie e per questo motivo lo sviluppo di nuovi farmaci e di nuovi
approcci terapeutici ha assunto un'importanza crescente.
Recentemente sono stati ideati nuovi approcci di trasferimento genico che permettono di
veicolare grazie a vettori virali delle molecole terapeutiche. In particolare i vettori virali basati
sul Virus Adeno-Associato (AAV) si sono dimostrati particolarmente efficienti per il
trasferimento di geni terapeutici al tessuto cardiaco grazie ad alcune peculiari caratteristiche.
Infatti i vettori mantengono meno del 10% del genoma virale, permettono espressione a lungo
termine anche in tessuti post-mitotici senza risposte infiammatorie e trasducono le cellule
bersaglio ad alta molteplicità d'infezione.
Recenti risultati del laboratorio di Medicina Molecolare dell'ICGEB hanno dimostrato
l’efficacia dei vettori AAV nel trasferire geni codificanti per proteine secrete, come ad
esempio esempio il fattore di crescita per l’endotelio vascolare (VEGF), ai tessuti ischemici
con conseguente rivascolarizzazione e rigenerazione del tessuto.
Con il recente completamento del “Progetto Secretoma”, è stato possibile avere a
disposizione l'intera collezione di cDNA murini e si è voluto sfruttare le caratteristiche dei
vettori AAV per identificare nuovi fattori secreti, possibilmente in grado di stimolare la
protezione e rigenerazione dei tessuti ischemici.
E' stata quindi sviluppata una strategia innovativa per l'identificazione di nuovi fattori secreti
coinvolti nella protezione da danni ischemici. La strategia di selezione si basa su
somministrazione in vivo di pool di vettori AAV esprimenti fattori secreti immediatamente
prima dell'induzione di danni ischemici o tossici. Successivamente i genomi virali vengono
estratti dalle cellule sopravvissute e tramite PCR è possibile osservare l'arricchimento di fattori
pro-sopravvivenza. Se un singolo ciclo di danno/selezione non è sufficiente i genomi virali
vengono riclonati per avviare la preparazione di nuovi virus che rientreranno in nuovi cicli di
selezione, con l’obiettivo finale di selezionare eventuali fattori pro-sopravvivenza o prorigenerazione espressi grazie ai vettori.
IV
Questa tesi si è focalizzata in particolare sulla preparazione della collezione di vettori virali,
sulle validazioni metodologiche del progetto e su esprimenti pilota in vivo.
Il primo obiettivo del progetto e’ stata la costruzione di una library di cDNA codificanti per i
fattori secreti murini clonati all'interno di un plasmide backbone per la produzione di vettori
AAV. Ad oggi, sono stati clonati oltre 120 cDNA all’interno del plasmide richiesto.
Per supportare la fattibilità del progetto si è ritenuto necessario testare la preparazione di pool
di vettori AAV a partire da miscele bilanciate di plasmidi. Siccome la presenza di quantità
equiparabili di cloni è un requisito fondamentale per questo screening, abbiamo testato
l'efficienza di incapsidamento dei diversi cDNA all'interno della stessa preparazione virale e il
livello di espressione di ciascun transgene in seguito alla trasduzione in vivo. In particolare
sono state studiate le possibili limitazioni date da numero e lunghezza dei cDNA per la
produzione di pool di vettori virali.
Considerato il carattere innovativo della strategia sperimentale, si è validato anche il metodo
di selezione dei cDNA in vitro, utilizzando un pool di AAV esprimente cinque fattori secreti e
la proteina fluorescente verde (GFP) come gene reporter. Si è dimostrato che la selezione
fenotipica delle cellule tramite il cell sorter consente di osservare nelle cellule positive alla
fluorescenza un arricchimento significativo del cDNA per GFP rispetto agli altri cDNA.
Questi risultati hanno supportato la fattibilità’ della selezione e hanno incoraggiato a
procedere con la preparazione dei pool di vettori AAV codificanti per 10 fattori secreti
differenti da utilizzare per la sperimentazione in vivo.
Per eseguire la procedura funzionale sono stati utilizzati in due modelli murini di patologie
cardiovascolari. Per il modello di ischemia del muscolo scheletrico topi adulti sono stati
trasdotti con una miscela di 30 vettori e la pressione selettiva è stata indotta da un danno
ischemico dovuto a ligazione dell'arteria femorale. Dopo tre cicli di selezione è stato possibile
identificare il gene pro-sopravvivenza grelina, già noto in letteratura per la sua attività
cardioprotettiva. Nel secondo modello murino topi neonati sono stati trasdotti con vettori ad
alto tropismo cardiaco e successivamente è stato indotto un danno miocardico simil-ischemico
tramite di isoproterenolo. Questo stimolo selettivo a permesso di identificare già al primo ciclo
di selezione il fattore INSL6 ( insulin-like peptide precursor ).
Questi risultati preliminari confermano l'efficienza della strategia, poiché è stato possibile
identificare direttamente in vivo due geni capaci di supportare protezione o rigenerazione
cellulare e tessutale. I fattori così identificati verranno saggiati individualmente per confermare
le loro proprietà e per caratterizzarne i meccanismi molecolari di azione.