PCR
Prof. Vincenzo Nigro
Dipartimento di Patologia
Generale, Seconda Università
degli Studi di Napoli
Telethon Institute of Genetics and
Medicine (TIGEM)
1978
Prima diagnosi molecolare sul DNA
*Primo ormone umano ricombinante (insulina)
*Premio Nobel agli scopritori degli enzimi di restrizione
*Identificato l’AIDS
*Prodotto il depakene (epilessia)
*Prima bambina in provetta (Luise)
*Appare sul mercato l’Apple Computer ed i floppy disk
Com’era l’analisi genetica prima
della PCR?
 Il Southern blotting (1975) permetteva un’analisi
approssimativa dei geni (RFLPs, inserzioni &
delezioni)
 Il sequenziamento del DNA (1978) richiedeva
che I geni venissero prima clonati in appositi
vettori (plasmidi o fago l)
 La costruzione di genoteche e lo screening
potevano richiedere molti mesi e le genoteche
dovevano essere preparate per ciascun
individuo analizzato
Restriction Enzymes cut in different ways:
L’invenzione della PCR
 Ideata da Kary
Mullis nel 1983
 La prima
pubblicazione è
apparsa nel 1985
 Premio Nobel per
la chimica nel 1995
1985
Descritta la reazione di
PCR
Parte il progetto genoma umano
Costo giornale £ 650
Tazzina Caffè £.400
Polymerase Chain Reaction - PCR
La PCR rappresenta la seconda rivoluzione nelle
tecniche di manipolazione del DNA
E’ essenzialmente una tecnica di amplificazione
del DNA
DNA
PCR
Molte
molecole
(singola molecola) amplificazione
Polymerase Chain Reaction
 Metodo per l’amplificazione esponenziale di
sequenze di DNA
 Ingredienti di base
 Stampo di DNA o RNA
 2 primers complementari a differenti regioni dello
stampo
 DNA polimerasi termostabile
 4 nucleotidi
 il buffer appropriato
Schema della PCR
DNA
Reverse
transcription
Estrazione del
DNA o
RNA dal campione
RNA
Amplificazione
DNA
Rivelazione
TIPICA MISCELA DI REAZIONE
25 o 50l in una provetta micro Eppendorf (0.2 o 0.5 ml)
COMPONENTE
VOLUME
Concentrazione
finale
10 X PCR Buffer
5l
1X
10 X dNTPs (2mM)
5l
200M
Forward primer
(5 pmols/l)
5l
0.5M
Reverse primer
(5 pmols/l)
5l
0.5M
(25pmols/50l)
DNA genomico stampo
2l
1g
polimerasi termostabile
(5U/l)
0.2l
1 unità
H2O (a 50l di volume finale)
27.8l
I cicli della PCR
 30–35 cicli ciascuno
comprendente:
 denaturazione
(95°C), 10-40 sec
 annealing (50–65°C),
30-120 sec
 polimerizzazione
(68-72°C),
il tempo dipende
dalla lunghezza del
frammento
Thermal cycler, AppliedBiosystems
Thermal Cyclers, MJ Research
Thermal Cyclers, MJ Research
“Tutti I blocchi sono uguali ma alcuni sono più
uguali di altri!”
Taken from http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/PCR.html
 Synthesis by DNA polymerase
5’
-T A C G T A C G T A
3’
-A T G C A T G C A T G C * *
Uno specifico DNA a singola elica (primer o
innesco) ibrida con l’elica che deve essere
copiata
Come funziona la PCR
 Come fa la polimerasi a sapere quando
fermarsi una volta che ha raggiunto l’altro
primer?
 PCR animation alla “Dolan DNA Learning
Center, CSHL, Cold Spring Harbor”
Quanto è potente la PCR?
 La PCR può amplificare fino ad ottenere una
quantità utilizzabile di DNA (visibile su gel) in
meno di 2 ore
 Lo stampo di DNA non necessita di
particolari purificazione se il frammento da
amplificare è di dimensioni ridotte (fino a
1000bp)
 Il prodotto della PCR può essere digerito con
enzimi di restrizione, sequenziato o clonato
 La PCR può amplificare una singola
molecola di DNA (es. uno spermatozoo)
Elettroforesi su gel : Separa le molecule per dimensione
separazione orizzontale --> Agarosio = DNA ed RNA
separation verticale --> Acrilamide = DNA, proteine ed RNA
le molecole più piccole migrano nel gel più velocemente
Elettroforesi su gel: visualizzazione diretta delle molecole
separazione orizzontale --> Agarosio = DNA ed RNA
Il DNA colorato con bromuro di etidio
emette una fluorescenza di colore rosso-arancio se
sottoposto a luce UV
THE GENOMIC SEQUENCE
Fifty years after the double
helix, the reference DNA sequence of
Homo sapiens is now available for
downloading. Annotation of genes
and other features is in progress.
Download Sequence Data
UCSC Genome Browser on Human July 2003 Freeze
Screenshot from University of California at Santa Cruz
http://genome.ucsc.edu PTEN gene
Mutation screening from genomic DNA
Mutation screening from RNA
by RT-PCR
Quante copie?
 Nessun prodotto fino al 3° ciclo
 L’accumulazione non è un
raddoppiamento completo dopo ciascun
ciclo
 Dopo 32 cicli ci dovrebbero essere max
1,073,741,764 copie di lunghezza definita
(~1109)
How Big A Target?
 Amplification products are typically in the
size range 100-1500 bp.
 Longer targets are amplifiable — >25 kb.
 Requires modified reaction buffer,
cocktails of polymerases, and longer
extension times.
 Limited by the integrity of the starting
target DNA — > 50 kb.
Designing PCR Primers
 Primers should be ~20 bases long.
 The G/C content should be 45–55%.
 The annealing temperatures should be
within 1°C of one another.
 The 3´-most base should be a G or C.
 The primers must not base pair with each
other or with themselves or form hairpins.
 Primers must avoid repetitive DNA
regions.
Primers That Form Dimers
 A primer may form a dimer with itself or
with the other primer.
5´-ACCGGTAGCCACGAATTCGT-3´
||||||||||
3´-TGCTTAAGCACCGATGGCCA-5´
 Primer dimers can be an excellent, but
unwanted, substrate for the Taq
polymerase.
Primers That Form Hairpins
 A primer may be self-complementary and
be able to fold into a hairpin:
5´-GTTGACTTGATA
||||| T
3´-GAACTCT
 The 3´ end of the primer is base-paired,
preventing it annealing to the target DNA.
Optimising the PCR Reaction
 Annealing temperature of the primers.
 The concentration of Mg2+ in the reaction.
 The extension time.
 (The denaturing and annealing times.)
 (The extension temperature.)
 (The amount of template and polymerase
— “more is less”.)
Optimising the Annealing
Temperature
 Primers have a
calculated annealing
temperature
(e.g. 54°C).
 Temperature must be
confirmed practically.
 Temperature steps of
2°C above and below.
 Use gradient cycler.
2+
Mg
Optimising the
Concentration
 The fidelity of the
PCR depends on
[Mg2+].
 Vary [Mg2+] in steps
of 0.5 mM.
 Sometimes a
compromise
between yield and
specificity.
ADDITIVi?
DMSO
Formamide
Glicerolo
QIAGEN – Q
Stratagene - Perfect Match
Nested PCR
False positive PCR
 Contamination
 at the time of specimen collection
 during transport
 in the laboratory from other patient samples or
positive control material
 negative controls used to detect contamination
 Primers are not specific enough
 do additional confirmatory tests
 PCR for other targets, additional tests to confirm
the identity of the product
General applications of PCR (1)
General applications of PCR (2)
Restriction site polymorphism analysis
by PCR
Genotyping
Allele-specific
PCR
Fidelity of the Reaction
 Taq DNA polymerase lacks the 3´5´
proof-reading activity commonly present in
other polymerases.
 Taq mis-incorporates 1 base in 104.
 A 400 bp target will contain an error in
33% of molecules after 20 cycles.
 Error distribution will be random.
Do Errors Matter?
 Yes, if you want to clone the amplified
DNA — an individual molecule may
harbour several mutations.
 No, if you want to sequence the amplified
DNA or cut it with restriction enzymes.
 Use a proof-reading thermo-stable
enzyme rather than Taq.
Cloning PCR Products
 Products should be ligatable into bluntended restriction enzyme site.
 Lower than expected efficiency.
 Products are not truly blunt-ended.
 Taq polymerase adds a single nontemplated base (usually A) to the 3´ end:
NNNNNNN…NNNNNNNA
ANNNNNNN…NNNNNNN
Cloning of PCR products
Can I PCR Amplify RNA?
 Not directly — the DNA polymerase
requires a DNA template and will not copy
RNA.
 mRNA can first be copied into cDNA using
reverse transcriptase.
 cDNA is a template for PCR — it need not
be double-stranded.
Multiplex PCR
 PCR reactions can be devised in which
several targets are amplified
simultaneously — often used in diagnostic
applications.
Sequencing PCR products
Automated DNA sequencing