Istruzioni per l'uso
ChromoQuant® Kit diagnostico QF-PCR1 ChromoQuant® in vitro per l'analisi dei disturbi cromosomici comuni nei
cromosomi 13, 18 e 21
412.001-48u
Vedere la confezione
Vedere la confezione
-18°°C
48
-25°°C
Precauzioni
Per l'uso con sequencer fluorescenti che supportano la serie di filtri D per analizzatori genetici Applied Biosystems ABI
PRISM3100, 310, 3130- e la serie di filtri 2 per Amersham Biosciences MegaBACE 500/1000. Verificare che il
sequencer possa supportare le etichette dei coloranti 6-FAM, HEX e NED.
Si raccomanda l'uso di questo kit con DNA purificato proveniente da fluido amniotico, tamponi boccali, saliva o sangue.
Il funzionamento del kit non può essere garantito qualora non venga utilizzata la Taq polimerasi raccomandata! La Taq
polimerasi NON è inclusa nel kit!
Utilizzare sempre > 15 ng - < 150 ng di DNA per campione PCR al fine di ottenere risultati di qualità
Per un risultato PCR ottimale, seguire le istruzioni fornite per lo strumento PCR disponibile.
Eventuali tappi PCR rotti devono essere sostituiti prima dell'amplificazione PCR.
Campioni di pazienti macchiati di sangue non devono essere analizzati con questo kit, ad esempio DNA proveniente da
fluido amniotico!
Al fine di evitare la contaminazione crociata durante la preparazione della PCR, verificare di aver inserito un nuovo
puntale di pipetta per ciascun pozzetto da riempire con il DNA.
Il sale interferirà con la separazione dei frammenti durante l'elettroforesi su gel. Si raccomanda la dissalazione dopo la
PCR.
La qualità della formamide o dell'acqua aggiunta al campione di DNA prima del caricamento o dell'iniezione
elettrocinetica influirà sulla sensibilità. Assicurarsi di usarne della migliore qualità.
I reagenti per la purificazione del DNA genomico non sono inclusi nel kit!
Composizione del kit
•
6 strip da 8 provette
Ciascuna provetta PCR contiene un primer mix pronto all'uso. Di conseguenza, una strip da 8 provette è
sufficiente a determinare provenienti da otto (8) pazienti.
•
Tappi per strip PCR.
•
1X tampone di diluizione enzimatica – 300 µL in una provetta con tappo a vite (colore bianco), (tampone Tris,
EDTA)
1X tampone QF-PCR – 1,5 mL in una provetta con tappo a vite (colore giallo)
(MgCl2, (NH4SO4)2, dNTP, β-mercaptoetanolo, albumina di siero bovino)
•
1
La procedura PCR è garantita dai brevetti USA 4.683.195 e 4.683.202 e dai brevetti stranieri equivalenti, di proprietà di Hoffman-La
Roche AB. L'utente deve essere in possesso di una licenza per l'uso della tecnologia PCR, rilasciata da Hoffman-La Roche.
# 901.116-412, Q07-129-IT02
1/4
Istruzioni per la conservazione e periodo di validità dopo la prima apertura
•
•
•
Conservare le provette PCR primer mix e il tampone QF-PCR non utilizzati al buio, a < -18°C. Il tampone di
diluizione enzimatica può essere conservato ad una temperatura compresa tra -20 e +8°C. Si raccomanda di
conservare sempre il materiale non utilizzato nel sacchetto di alluminio originale risigillabile.
Utilizzare fogli di alluminio ogniqualvolta risultino appropriati per proteggere le provette dall'esposizione
superflua alla luce, ad esempio quando si lavora con il kit sul tavolo di lavoro del laboratorio prima della PCR.
Periodo di validità: Vedere la data di scadenza.
Reagenti speciali aggiuntivi richiesti, da procurarsi da parte dell'utente
•
•
•
•
-1
HotStar Taq polymerase, Qiagen #203203, 250U [5U µL ]
Fluorescente misura standard per elettroforesi su gel, ad esempio ABI GeneScan-500 [ROX], codice
prodotto 401734 oppure Amersham Biosciences ET-ROX, codice prodotto 25-6550-01. Viene aggiunto al
campione del DNA dopo la PCR ma prima dell'elettroforesi su gel.
Colonne per la dissalazione del prodotto della PCR prima dell'elettroforesi su gel nei capillari.
Altri reagenti per la purificazione del DNA genomico.
Procedura
Purificazione e amplificazione del DNA
I reagenti per la purificazione del DNA proveniente da tessuto umano NON sono inclusi nel kit. Si raccomanda di
utilizzare tecnologie in commercio per la preparazione del DNA che forniscano un DNA genomico puro.
Indipendentemente dal metodo di preparazione, diluire il DNA in modo da ottenere una concentrazione di 1,5-15 ng/µL
utilizzando acqua sterile.
Amplificazione PCR multiplex del DNA genomico
1.
2.
3.
Portare a temperatura ambiente il tampone QF-PCR e il tampone di diluizione enzimatica e posizionarli sul
ghiaccio.
Determinare il numero totale di provette PCR (N).
Miscelare in una microprovetta di polipropilene separata (ad esempio provetta Eppendorf da 1,5 mL)
•
1,6 µl di tampone di diluizione enzimatica, 0,4 µL di Taq polimerasi e 13 µL di tampone QF-PCR moltiplicati
per N. Preparare sempre una quantità di riserva.
Le provette PCR in dotazione nel kit sono disposte in strip da 8 l'una. Una strip analizzerà 8 campioni di
pazienti.
Per ottenere ottimi risultati, si raccomanda di lavorare velocemente sul ghiaccio.
4.
5.
Aggiungere 15 µL di master mix (vedere punto 3) in ciascuna provetta PCR
Aggiungere 10 µL di campione del DNA (15-150 ng). Miscelare pompando la pipetta (5X). Volume finale 25 µL.
6.
Percuotere delicatamente le provette nella strip sul tavolo di lavoro del laboratorio, oppure farle ruotare in una
microcentrifuga per assicurarsi che tutti i reagenti di depositino sul fondo delle provette PCR.
Eseguire immediatamente l'amplificazione PCR.
7.
# 901.116-412, Q07-129-IT02
2/4
Protocollo PCR:
Le operazioni ai punti 2-4 sono ripetute per 26 cicli.
Fase
N° di cicli
Temp.
Tempo
1 HotStar
1
95oC
15 Min
2
Ripetizione 26
94oC
30 S
3
"
57oC
1 Min
4
"
71oC
2 Min
5
1
71oC
5 Min
6
1
60oC
1H
7
Attesa
4 oC
∞
Elettroforesi su gel dei frammenti di DNA amplificato
Dissalare singolarmente ciascun campione PCR prima dell'iniezione elettrocinetica nei capillari.
Eseguire l'elettroforesi su gel in base al manuale dello strumento o alla migliore prassi di laboratorio per ottenere una
risoluzione ottimale dei frammenti compresa tra 135 e 500 nucleotidi.
Limiti del metodo e caratteristiche delle prestazioni
Le informazioni del marker provenienti da ciascun cromosoma sono 4 volte in eccesso (cromosoma 13, 18 e 21). Un
risultato analitico in cui due dei marker per un particolare cromosoma sono informativi deve essere ritenuto valido e può
essere utilizzato come indicazione diagnostica.
Il kit non è destinato ad essere utilizzato per valutare o determinare se sia avvenuta una traslocazione che abbia
interessato i cromosomi 13, 18 e 21.. Tuttavia, può essere possibile valutare uno stato trisomico a livello cromosomico. Il
kit non deve essere utilizzato al fine di valutare aberrazioni genetiche a mosaico (ad esempio lionizzazione
Normale 1:1
Eterozigote
Omozigote Non
informativo
Trisomia
1:1:1
Trisomia 2:1
Il rapporto di picco normale all'interno di un STR è 0,8-1,4. Il rapporto di picco della trisomia è <0,65 e >1,8. L'area o
l'altezza dell'allele più corto sono divisi per l'area o l'altezza dell'allele più lungo. I rapporti degli alleli che rientrano tra i
range normale e anormale sono classificati come non conclusivi e devono essere rianalizzati. Se sono ottenuti modelli di
allele sia normale sia anormale per un singolo cromosoma, il risultato finale non deve essere interpretato come normale
o anormale. Devono essere effettuati adeguati studi di follow-up.
Per informazioni dettagliate sull'interpretazione dei risultati, consultare la Guida per l'utente di ChromoQuant. La Guida
per l'utente può essere scaricata dal sito Web di ChromoQuant, oppure ordinata direttamente presso CyberGene AB.
Codice prodotto 901.115-00.
# 901.116-412, Q07-129-IT02
3/4
Marker
Posizione
E
Cromosoma
STR
Misura bp
Colore
13
230-326
Verde
HEX
13
380-445
Blu
6-FAM
13
420-475
Giallo
NED
13
425-470
Verde
HEX
18
135-185
Verde
HEX
18
171-201
Blu
6-FAM
18
330-405
Verde
HEX
18
450-505
Blu
6-FAM
21
220-285
Giallo
NED
21
282-336
Blu
6-FAM
21
226-267
Blu
6-FAM
21
150-210
Giallo
NED
13q12.13
G
13q21.33
H
13q31.1
I
13q13.3
B
18p11.31
C2
18p11.31
F
18q22.1
J
18q12.3
L
21q21.1
N
21q22.2
M
21q22.13
S
21q21.3
B
M
S
N
L
E
G
H
J
F
C2
I
CyberGene AB, Box 30057, 10425
Stockholm, Svezia
# 901.116-412, Q07-129-IT02
4/4