…un po’ di teoria:
CROMATOGRAFIA
Pochi metodi in chimica analitica sono specifici per un particolare analita. Spesso quindi
l’analita d’interesse deve essere separato da una miscela di altre sostanze che possono
essere presenti nel campione.
Le tecniche cromatografiche permettono sia la separazione che la determinazione
dell’analita presente in una miscela campione.
CROMATOGRAFIA - Principi
I componenti della miscela campione vengono trasportati da una fase mobile
(o fase eluente, che può essere un gas, un liquido o un fluido supercritico)
attraverso una fase stazionaria immiscibile nella fase mobile.
Ciascun componente della miscela campione viene “rallentato” per effetto delle
interazioni con la fase stazionaria che possono essere:
•
Adsorbimento superficiale (cromatografia di adsorbimento)
• Solubilità relativa (cromatografia di ripartizione)
• Elettrostatiche (cromatografia ionica)
TIPI di CROMATOGRAFIA
Metodo di separazione che si basa sulla distribuzione degli analiti tra una fase mobile e
una fase stazionaria.
Eluizione degli analiti può avvenire:
•
•
•
•
Capillarità
Gravità
Pressione
Potenziale Elettrico
CROMATOGRAFIA
COLONNA
GC
Scambio
ionico
CCE
LC
PLANARE
TLC
SFC
Carta
Elettroforesi
Esclusione
Adsorbimento
Ripartizione
Fase Normale
(fase stazionaria polare
fase mobile non-polare)
Fase inversa
(fase stazionaria non-polare
fase mobile polare)
CROMATOGRAFIA - Teoria
Distribuzione degli analiti tra le due fasi
Può essere descritta in modo semplice considerando il seguente equilibrio:
Amobile
Astazionaria
La costante d’equilibrio, K, è detta coefficiente di ripartizione ed è data da:
K = [A]stazionaria / [A]mobile
Il tempo che intercorre tra l’iniezione del campione e l’uscita dell’analita dalla colonna per
raggiungere il rivelatore è detto tempo di ritenzione (tR ). Ciascun analita nel campione
avrà differenti tempi di ritenzione.
Il tempo che impiega la fase mobile ad attraversare la colonna è detto tempo morto (tM).
Il termine definito fattore di ritenzione, k', è spesso
utilizzato per descrivere la velocità di migrazione
dell’analita nella colonna. Viene spesso definito anche
fattore di capacità. Per l’analita A il fattore di
ritenzione è dato da:
k'A = (t R - tM )/ tM
t
e tM si ottengono direttamente dal cromatogramma. Quando il fattore di ritenzione è
< 1, l’eluizione è talmente veloce che è praticamente impossibile determinare
accuratamente il tempo di ritenzione. Fattori di ritenzione elevati (> 20) sono indice di
lunghe eluizioni. I fattori di ritenzione ideali sono compresi tra 1 e 5.
R
Per descrivere la separazione di 2 specie A e B in colonna è utile definire il
fattore di selettività (a):
a = k 'B / k 'A
Nel rapporto si pone al denominatore la specie che eluisce più velocemente
in modo tale che sia sempre a > 1.
Maggiore è questo rapporto e migliore sarà al separazione.
Per ottenere delle ottime separazioni è necessario che i picchi siano stretti e
simmetrici, è quindi necessario fare in modo che non si verifichino
allargamenti di banda, scegliendo opportunamente le condizioni operative
(eluente e fase stazionaria) e valutando anche l’efficienza della colonna.
CROMATOGRAFIA – Efficienza della separazione
Due fattori contribuiscono a determinare la qualità della separazione di 2 componenti:
• Differenza fra i tempi di eluizione dei picchi (più sono distanti, migliore è la separazione)
• Larghezza dei picchi (più sono larghi, peggiore è la separazione)
Un soluto che si muove attraverso la colonna cromatografica tende ad espandersi in forma
approssimativamente gaussiana con deviazione standard s. Maggiore è il tempo impiegato
dal soluto per attraversare la colonna e più larga sarà la banda. Le comuni misure della
larghezza sono:
w1/2 = larghezza a metà altezza e w = larghezza all’intersezione della linea di base con le
tangenti tracciate lungo le parti più ripide del picco
L’equazione che descrive un
picco gaussiano è:
y 
2
1
e (x   )
s 2
2s 2
Da cui si può dimostrare che
w1/2 = 2.35 s e w = 4 s