Cromatografia
Generale
Un sistema cromatografico…
 Si compone di TRE elementi
1.
2.
3.
essenziali che lo caratterizzano
SEMPRE :
Una fase STAZIONARIA
Una fase MOBILE
L’analita (o una miscela di analiti)
Cromatografia
1. Analisi antidoping e degli stupefacenti
2. Metabolismo di xenobiotici e farmaci
3. Inquinanti ambientali (aria, terreni, acqua)
4. Analisi DNA, purificazione proteine
5. Analisi degli alimenti
6. Analisi dei profumi e dei cosmetici
7. etc etc.
CROMATOGRAFIA
La CROMATOGRAFIA interessa la separazione di
miscele liquide complesse.
La separazione avviene grazie alle differenze nei
coefficienti di distribuzione (equilibrio di
distribuzione) delle specie chimiche presenti nel
campione tra 2 FASI differenti.
Una di queste fasi è la fase mobile e l’altra è la fase
stazionaria.
- Stesso principio dell’estrazione con solvente !!!
Coefficiente di distribuzione
(Equilibrio di distribuzione )
Definizione:
Concentrazione del componente A nella fase stazionaria
K distr =
Concentrazione del componente A nella fase mobile
La diversa affinità di 2 componenti la miscela verso la fase
stazionaria determina la separazione cromatografica
K distr
Amobile
Astazionaria
Tipi di Cromatografia
1. Cromatografia Liquida su Colonna
(HPLC)
2. Gas Cromatografia
(GC)
3. Cromatografia su strato sottile
(TLC)
Processo Cromatografico
Sistemi Cromatografici
Tecniche Cromatografiche
TLC/PC
PC-Paper Chrom
HPLC
GC/SFC
Cromatografia – Meccanismo separazione
 Adsorbimento
 Partizione
 Scambio Ionico – Interazione ionica
 Esclusione dimensionale
 Affinità (interazione anticorpo-antigene;
interazione chimica; attrazione)
 Complessazione - Chelazione
Problemi di assorbimento!!!!!
ASsorbimento
ADsorbimento
Diversi tipi di assorbimento
Cromatografia – Meccanismo di Separazione
Adsorbimento
Partizione
Scambio ionico
Cromatografia – Meccanismo di Separazione
Affinità
Esclusione dimensionale
Cromatogramma – Parametri di base
tR = Tempo di ritenzione
tm = Tempo morto
W1/2
1/2H
Picco non trattenuto
H
Teoria Cromatografica
 Tempo di ritenzione :
tR’ = tR – tM
 Teoria dei piatti – distillazione –
numero di piatti
N = 5.54[(tR – tM)/w1/2]2
 Altezza dei piatti H = L/N
 Questa teoria non tiene conto della interazione degli
analiti con la fase stazionaria
Cromatografia – Allargamento dei picchi
Cromatografia - Teoria
 Teoria delle velocità – fattori cinetici –
van Deemter
H = B/u + Cu (+ A)
Dove:
u – velocità della fase mobile
B – effetto della diffusione molecolare
C – resistenza al trasferimento di massa
A – allargamento dovuto alla diversa
distanza percorsa dalle molecole
nelle colonne impaccate
Cromatografia – Effetto dell’impaccamento
sull’allargamento dei picchi
Parametri di van Deemter (B) :
Diffusione Molecolare (B) – nella fase
mobile:
 proporzionale al tempo che l’analita passa
nella colonna
 influenzato dal coefficiente di diffusione
dell’analita nella fase mobile
 influenzato dalla temperatura e pressione
 poco importante in LC – basso coefficiente
di diffusione
 inversamente proporzionale alla velocità
della fase mobile
Parametri van Deemter (C):
Resistenza al trasferimento di massa (C):
 trasferimento di massa nelle fasi stazionaria e
mobile
 mancanza di equilibrio – fase mobile
 influenzata dallo spessore della fase liquida
 inversamente influenzata dal diamentro delle
particelle o dal diametro interno della colonna
capillare
 diminuisce all’aumentare della temperatura
(viscosità)
Parametri van Deemter:
Conclusioni:
 Il più basso valore di H si ottiene quando:
 lo spessore della fase stazionaria è minimo
 la colonna è impaccata con particelle molto fini
 le colonne capillari hanno il diametro più piccolo
 la fase mobile e stazionaria mobile hanno bassa
viscosità e elevato coefficiente di diffusione
Altezza dei piatti (cm)
Cromatografia – van Deemter
H
Cu
Trasferimento di massa
A
Effettomultipercorso
B/u Diffusione (Longitudinale)
Velocità fase mobile
Cromatografia - Risoluzione
R = 2(tR1 – tR2)/Wb1 – Wb2
tR1 tR2
DtR
Response
100%
Baseline resolution
for Gaussian
shape peaks = 1.5
Wb1
Wb2
Cromatografia - Risoluzione
 Equazione per il parametro di risoluzione
Rs = ½ x (a-1/a+1) x k’2/1+k’2x (L/h)1/2
Dove: a – fattore di selettività (separazione) a = tR1/tR2
k’ – termine di migrazione, fattore di capacità;
k’ = ms/mm
L – lunghezza della colonna
h – altezezza piatto
Chromatography - Resolution
Cromatografia
 Analisi Qualitativa
 Retention data – RT; Rf; RRT; Kovacs
Index
 Analisi Quantitativa
 Peak ar ea and height usually proportional
to the amount of component
 Calibration
 Internal Standard method
 External Standard method
 Area Normalization method
Chromatogram – Basic Parameter
tR = retention time
tm = dead time
W1/2
1/2H
unretained
H
THE END