Principali tecniche analitiche su
aerodisperso e biologico
22 marzo 2014

Oltre che a livello di singolo individuo, i dati analitici
servono per la dimostrazione e valutazione
dell’esposizione di gruppi di soggetti esposti in ambito
di lavoro e di vita.

I risultati analitici possono indurre modifiche
tecnologiche, procedurali, organizzative…effetti sulla
posizione lavorativa del soggetto interessato..

Attività di livello tecnico elevato - molto
elevato,difficilmente o affatto automatizzabile

Necessità di attento controllo di tutte le fasi:
- Pre-analitiche
- Analitiche
- Interpretazione del dato

Evoluzione limiti quantizzazione

Accanto a tecniche standardizzate si richiede spesso
l’uso di metodiche messe a punto ad hoc presso le
singole strutture

Impiego di strumentazione che richiede aggiornamenti
rapidi, adeguamenti, integrazioni.
SEGNALI
INFORMAZIONI QUALITATIVE
INFORMAZIONI QUANTITATIVE
Principali tecniche analitiche in
Igiene Industriale
Cromatografia
 gascromatografia
 cromatografia liquida
Spettrofotometria UV-VIS
Spettroscopia di assorbimento atomico
• fornetto di grafite
• fiamma
Plasma ad accoppiamento induttivo - MS
MATRICI
AMBIENTALI
Eluizione con
solvente
idoneo
ANALISI
SPE
MATRICI
BIOLOGICHE
Come
“pulire”
il campione?
Estrazione in fase
solida
Estrazione
liquido-liquido
Ora che il
campione è già
“pulito”
posso pensare a
come analizzarlo
…
Scelta della metodica analitica
Norme Tecniche
Metodiche ufficiali
Metodiche interne
- NIOSH
- OSHA
- EPA
Procedure analitiche
messe a punto dal laboratorio
(validate o parzialmente validate)
Vediamo ora in
dettaglio alcune delle
tecniche analitiche
che si hanno a
disposizione
in un laboratorio di
Igiene Industriale…
CROMATOGRAFIA
Tecnica separativa
GASCROMATOGRAFIA
CROMATOGRAFIA
LIQUIDA AD ALTA PRESSIONE
(HPLC)
Basata sulla diversa ripartizione
di varie sostanze tra una fase stazionaria
ed una mobile, in funzione dell’affinità di ogni
sostanza con la fase mobile.
Gas
Mix di solventi
Schema di un gascromatografo
INIETTORE
Istantanea vaporizzazione
del campione
La fase mobile
è un gas.
Colonne:
- impaccate
- Capillari (più usate)
Che tipo di segnale ottengo?
…un cromatogramma…
Tempo di ritenzione
Che tipo di informazioni ottengo
guardando il cromatogramma?
QUALITATIVO
Osservando il tempo di ritenzione
(Tr).
Valuto la presenza o assenza
dell’analita ricercato.
QUANTITATIVO
Costruendo una curva di
calibrazione a partire da soluzioni
dell’analita a concentrazioni note
crescenti.
Devo sapere cosa sto cercando!!
…..Confronto Tr campione vs Tr
della soluzione standard dell’analita.
RIVELATORI per GC
RISPONDE SOLO A :
composti che
possono bruciare
- composti organici
(aromatici, anestetici)
- idrocarburi
IONIZZAZIONE
DI FIAMMA (FID)
Distruttivo
Flame Ionization Detector
Si basa sulle capacità di
ionizzazione delle sostanze uscenti
dalla colonna da parte di una
microfiamma alimentata da idrogeno
e aria purissima (bombola) come
comburente
Sensibilità:
molto elevata..
(nanogrammi)
RIVELATORI per GC
RISPONDE SOLO A :
composti che possiedono
elettroni delocalizzati
- composti alogenati
(anestetici, solventi
clorurati
pesticidi..)
CATTURA DI
ELETTRONI (ECD)
Electron Capture Detector
NON Distruttivo
Sensibilità:
elevatissima..
(picogrammi)
GC - Spettrometro di Massa
MS = IDENTIFICAZIONE
GC = SEPARAZIONE
GC
Spettro di massa
2-butanone
IDENTIFICAZIONE
DEI COMPOSTI IN CAMPIONI
INCOGNITI
SENSIBILITA’ ALTISSIME
(ppb) – (SIM)
ELIMINAZIONE
DELLE INTERFERENZE !!!
POSSIBILITA’ DI
INIETTARE
GRANDI VOLUMI DI
CAMPIONE E PRECONCENTRANDO
(CRIOFOC.)
ULTERIORE INCREMENTO
DI SENSIBILITA’
Applicazioni GC-MS
in matrici ambientali
· determinazione di idrocarburi
policiclici aromatici (IPA) nell’aria
· determinazione delle PCB (policlorobifenili) nelle emissioni industriali o da
inceneritori
· determinazione di idrocarburi
aromatici (benzene) nell’aria
· determinazione di composti organici volatili
(VOC) nell’aria
(tecnica della preconcentrazione con criofocalizzatore)
· determinazione di pesticidi nel suolo e nei rifiuti solidi urbani e agricoli
· determinazione di sostanze tossiche nei rifiuti speciali
· determinazione di solventi organici in tracce presenti nelle acque di falda
(tecnica dello spazio di testa)
il campione viene messo in un contenitore
sigillato, semipieno, chiuso con un setto di
gomma perforabile.
Si termostata il contenitore ad una certa
temperatura e con una siringa, perforando il
setto, si preleva il vapore che si trova in
equilibrio con il liquido nello “spazio di testa“
del contenitore.
Si inietta così, non la matrice ma i componenti
volatili “arricchiti” presenti nell’atmosfera in
equilibrio con la matrice stessa
Anestetici
Solventi
Clorurati
CROMATOGRAFIA LIQUIDA AL ALTE
PRESSIONI - HPLC
Fase
mobile
Colonne:
-Lughezza 10-30 cm
diam. int. 4-10mm
-Materiale di riempimento:
Inorganico: silice, allumina
Organico
polimerico
fotometrici
fluorescenza
elettrochimici
massa
RIVELATORI per HPLC
1
FOTOMETRICI o
ad ASSORBANZA
ASSORBIMENTO
NEL UV-VIS
Misurano la perdita di intensità
di luce visibile o ultravioletta
dovuta al passaggio di analiti
presenti nella fase mobile.
Maggiore sensibilità di 2 vs 1 ( di solito superiore a un ordine di grandezza).
Minore campo di applicabilità di 2 vs 1 dato che il numero delle specie assorbenti è notevolmente
superiore rispetto a quelle fluorescenti.
2
selettivo
FLUORESCENZA
Misurano l’intensità della
radiazione di fluorescenza
quando un analita viene eccitato
con una radiazione di opportuna
lungh. d’onda
analiti volatili o
volatilizzabili,
termicamente
stabili, non ionici
• gas anestetici
• solventi
• idrocarburi aromatici
• composti clorurati
GC
(come tali e/o metaboliti)
analiti non volatili
o poco volatili,
ionici, ionizzabili o
non ionici,
termicamente
instabili
• aldeidi : formaldeide
• ammine specifiche:
(IPPD, 6-PPD)
• farmaci
• isocianati
• chemioterapici
• metaboliti di IPA
• metaboliti di solv.aromatici
HPLC
Il mondo dei METALLI
Spettroscopia di Assorbimento
Atomico (AAS)
Plasma ad accoppiamento
Induttivo (ICP –MS)
- biologiche
-ambientali
(come acque e terreni)
- alimenti
- leghe metalliche.
Quali matrici posso
analizzare?
Spettroscopia di assorbimento
atomico (AAS)
PRO
CONTRO
- Elevata selettività
ed specificità
- Semplicità di
utilizzo
SORGENTE di radiazione
Lampada a catodo cavo
ATOMIZZATORE
- Fiamma
Monocromatore
-LdR più bassi
(1000 volte più bassi)
-Possibili
interferenze
-Fornetto di grafite
- Analisi quantitative
Ogni elemento richiede
una lampada diversa
- Posso analizzare
SOLO UN
ELEMENTO ALLA
VOLTA
Range : 0.5 – 100 ppb
- Bastano pochi
microgrammi
di campione.
Plasma ad accoppiamento
induttivo – MS (ICP-MS)
-Possibilità di analisi multielementare
- alta sensibilità (ppt)
- Riduzione tempi di analisi
- possibilità di screening
6000 – 10000°C
Sorgente
al plasma
Gas elettricamente
neutro
ionizzato da scarica
elettrica
ed accellerato da
campo magnetico
- Possibili interferenze
- manutenzione complessa
- necessario pre-trattamento del campione
ioni
aerosol
- costo elevato
Campioni acquosi
…e
finalmente il nostro Medico
Competente, dopo tanta attesa, riceve il rapporto di prova…
Qualità del dato analitico
Il risultato fornito da un laboratorio riguarda determinazioni
analitiche…..
?
…non esiste…!
esiste un
Tale intervallo rappresenta l’INCERTEZZA DI
MISURA e può essere più o meno ampia in
dipendenza della metodica analitica.
Certificazione-Garantisce la
qualità del processo produttivo
ma NON il prodotto…
“Accreditamento della prova”
Assicura la qualità del dato analitico…
Procedure di qualità e incertezza..
Laboratorio accreditato o no DEVE garantire
i dosaggi siano effettuati seguendo un percorso di qualità
interno (CQI) ed esterno (CQE)
elemento importante per la
corretta interpretazione ed
utilizzo dei dati.
che:
Cosa significa: CONTROLLO DI
QUALITA’ INTERNO?
Serie di procedure che
assicurano la BONTA’
del dato analitico
prodotto.
Utilizzo materiali certificati
Validazione dei metodi
• Selettività/Specificità
• Sensibilità
• Limite di rilevabilità (LdR)
• Limite di quantificazione (LdQ)
• Accuratezza
• Precisione
MC
Controllo Qualità Interno
Utilizzo materiali certificati e/o materiali
di controllo
campione liofilizzato di urina, sangue o siero contente uno o più analiti
In concentrazioni note e certificate da un Ente preposto.
Durante l’analisi, il MC viene trattato nello stesso identico modo dei
campioni. La concentrazione ottenuta va confrontata con il
documento riportante la concentrazione (o range di concentrazione)
attesa del MC
MA….
Va usato SEMPRE….
PROBLEMA 1
….non sono disponibili in commercio
materiali certificati per tutti gli analiti dosati
in Igiene Industriale
PROBLEMA 2
Sono molto costosi
Controllo Qualità Interno
Validazione dei metodi
• Selettività/Specificità
• Sensibilità
• Limite di rilevabilità (LdR)
• Limite di quantificazione (LdQ)
• Accuratezza (confronto con MC)
• Precisione (ripetibilità e riproducibilità)
Controllo Qualità Interno
Validazione dei metodi
LIMITE DI RILEVABILITA’:
Minima quantità di analita rilevabile con
un determinato metodo analitico.
LIMITE DI
QUANTIFICAZIONE:
Concentrazione più bassa di analita che può
essere quantificata con un determinato
metodo.
Controllo qualità esternoCircuiti interlaboratoriali
Lo stesso campione viene analizzato
da tutti i laboratori
Nazionali
Tutti i laboratori partecipanti forniscono un risultato che
viene poi inserito nella trattazione statistica dei dati.
Valutazione “performance” del laboratorio
Partecipazione deve essere programmata
più volte all’anno….NON solo una volta ogni tanto…
I costi e problematiche nel
mantenere il processo di Qualità
1
Limite di rilevabilità della tecnica analitica
utilizzata deve essere inferiore al valore limite
col quale state confrontando il dato analitico…
Es. BEI :
LdR:
5 ug/l
10 ug/l
Utilizzo di:
2
3
Tecniche analitiche specifiche
e sensibili
Procedure di mantenimento del
processo di qualità
Maggiore attendibilità
del dato