UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI NAPOLI
Prof. S. Andini
CROMATOGRAFIA
La cromatografia è una tecnica impiegata per la Separazione dei
componenti (analiti) di una miscela, e consente quindi di Identificare i
diversi analiti della miscela.
Miscela di componenti da separare B  e A
Miscela A+B
Processo
cromatografico
B
A

Principi Teorici
Perchè i componenti si separano
La tecnica cromatografica utilizza due fasi immiscibili tra loro:
una fase stazionaria o fissa (solida o liquida),
e una fase mobile (liquida o gas)
Qualsiasi tipo di cromatografia si basa sulla ripartizione dell’analita
fra la fase fissa e la fase mobile
La RIPARTIZIONE di mobile
La RIPARTIZIONE
Metodi Cromatografici
3-In colonna si vedono le bande colorate separarsi; si aggiunge alla colonna altro CS2
clorofilla
A e B
Eluente CS2
Richiami sulle Tecniche cromatografiche
•
Tra le tecniche più idonee all’analisi di campioni vi sono le cosiddette
tecniche cromatografiche, utilizzate per separare e identificare
singolarmente i componenti di una miscela
Tipi di cromatografia



In base alla forma del letto cromatografico
Cromatografia su colonna (impaccata, opentubular)
Cromatografia planare (su carta, su strato
sottile)
In base allo stato fisico della fase mobile
Cromatografia Liquida (LC)
Gascromatografia (GC)
Cromatografia fluida supercritica (SFC)
In base al meccanismo di separazione
Adsorbimento
Ripartizione
Scambio ionico
Esclusione
Affinità
Meccanismi principali di separazione
Adsorbimento: La fase stazionaria è un solido.
Ripartizione: La fase stazionaria è un
liquido, che impregna un solido granulare
inerte.
Scambio ionico: La fase stazionaria è
costituita da macromolecole con siti attivi
ionizzati, i cui controioni possono essere
scambiati con quelli eluiti nella fase
mobile
Meccanismi principali di separazione
Esclusione: La fase stazionaria è un
solido poroso. In tali pori possono sostare
le molecole degli analiti.
Quale tecnica usare?

analiti volatili o volatilizzabili, termicamente stabili, non ionici

Gascromatografia

analiti non volatili o poco volatili, ionici, ionizzabili o non ionici,
termicamente instabili

Cromatografia liquida

analiti non volatili o termicamente instabili ma non rivelabili dai comuni
detector per LC

Cromatografia fluida supercritica
Gascromatografia
Nella gascromatografia il campione è vaporizzato e poi iniettato in colonna;
un gas costituisce la fase mobile ma in questo caso non ha alcuna interazione
con i soluti in quanto agisce soltanto da carrier, cioè trasporta i soluti lungo la
colonna
I composti iniettabili in un sistema GC devono avere Teb < 300°C e non devono
essere termolabili, ovvero non devono degradarsi per effetto della
temperatura, pena l’impossibilità di riconoscerli nel campione.
Metodi di classificazione
Una prima classificazione si può fare in base allo stato fisico della fase stazionaria:
cromatografia gas-solido (GS)
cromatografia gas-liquido (GL)
Gas-solido
 fasi stazionarie di silice,
allumina o carbone
 meccanismo di adsorbimento
 adatta per la separazione di
gas come H2, He, Ar, O2, N2,
CO o idrocarburi a basso
punto di ebollizione
Gas-liquido
• supporto inerte solido
• liquido non volatile, legato covalentemente
• meccanismo di ripartizione
• moltissime applicazioni
Metodi di classificazione
Una seconda classificazione prende in considerazione sia la geometria della
colonna e la collocazione della fase stazionaria in essa:


Colonne impaccate
 contengono un supporto solido inerte, finemente suddiviso
(comumente basato su terra di diatomee), ricoperto di fase
stazionaria liquida
Colonne capillari
 WCOT (Wall Coated Open Tubular), strato sottile di fase liquida (1
µm) depositato sulla superficie
 SCOT (Support Coated Open Tubular), strato poroso creato sulle
pareti della colonna per trattamento o deposizione chimica
 PLOT (Porous Layer Open Tubular), strato poroso polimerico o
inorganico che funge da fase stazionaria per una cromatografia di
adsorbimento
•Colonne capillari
Forno di un gascromatografo in cui è visibile la
colonna avvolta a spirale attorno al sostegno metallico
Confronto tra colonne impaccate e capillari
Le colonne capillari possono
essere lunghe fino a 100 m e
hanno quindi un numero di
piatti teorici enormemente più
elevato rispetto alle colonne
impaccate. Questa differenza è
esemplificata nella figura a lato
(in alto separazione con
colonna capillare, in basso la
stessa separazione con colonna
impaccata)
Schema di un GC
Il carrier (elio, azoto, argon, idrogeno) deve avere un’elevata inerzia chimica
nei confronti della fase stazionaria e del materiale di cui è costituita la
colonna.
Non deve essere segnalato dal rivelatore o deve fornire un rumore di fondo
trascurabile
Cromatografia di ripartizione (o gas-liquido, GLC)
Caratteristiche fondamentali della fase stazionaria:
 Bassa tensione di vapore (il punto di ebollizione della fase
stazionaria liquida deve essere di almeno 100 °C superiore
alla massima temperatura di operazione della colonna)
 Stabilità chimica
 Alta viscosità
Fasi stazionarie più comuni:
Polisilossani, polifenileteri, poliesteri,polietilenglicoli
Materiale di supporto per la fase stazionaria in GLC
Caratteristiche fondamentali:
•Distribuzione regolare delle dimensioni delle particelle
•Buona conducibilità termica
•Stabilità meccanica e termica
•Elevato rapporto area superficiale/massa
Il materiale di supporto in assoluto più usato è costituito da terre di
diatomee calcinate (Chromosorb), costituite dai residui fossili di piante
unicellulari.
Programmazione della temperatura di lavoro
Confronto tra
cromatografia a
temperatura costante
(isoterma, caso a) e a
temperatura
programmata (caso b)
di idrocarburi lineari
Rivelatori per GC
Uno dei punti di forza della tecnica GC è la grande varietà dei rivelatori disponibili.
Alcuni sono aspecifici e quindi di uso generale (TCD, FID), altri sono invece molto
specifici. Quelli universalmente accettati sono TCD ed FID, ma è sempre più diffuso
l’impiego del rivelatore a spettrometria di massa (MS):
Rivelatori più utilizzati:




a conducibilità termica (TCD)
a ionizzazione di fiamma (FID)
a cattura di elettroni (ECD)
a ionizzazione in fiamma termoionico
(rivelatore azoto-fosforo, NPD)
Scelta del rivelatore
La selezione è basata su:

natura chimica degli analiti

potenziali interferenze

limite di rivelabilità richiesto

disponibilità e/o costo
Rivelatore a termoconducibilità (HWD)




si misura la variazione di
conducibilità termica in un flusso
di H2 ed He (Conducibilità
termica di elio ed idrogeno è
circa 6– 10 > composti organici
e non)
si tratta di un rivelatore non
specifico, quindi risponde ad
ogni tipo di composto
la sensibilità è una delle
peggiori
è un sistema non distruttivo
Campione
Riferimento
Rivelatore a ionizzazione di fiamma






si misura la conducibilità elettrica di una
fiamma in un campo elettrico
è sensibile a tutti i composti contenenti
legami C-C e C-H (per questo si tratta del
rivelatore più utilizzato)
In seguito alla combustione e quindi alla
ionizzazione dell’analita, si crea una
corrente elettrica fra i due elettrodi,
proporzionale alla concentrazione
non risponde a molecole volatili non
infiammabili
la sensibilità è buona
è un sistema distruttivo
E’sensibile soprattutto ai composti idrocarburici.
Non è sensibile ai composti inorganici del carbonio (CO2, CO, ecc.), né ad
altri composti inorganici (NH3, SO2, NOx).
Rivelatore a cattura di elettroni


si misura la diminuzione di corrente
dovuta alla cattura di elettroni da parte
di analiti all’uscita della colonna
è sensibile soprattutto a composti con
gruppi funzionali elettrofili (alogeni,
perossidi, nitrogruppi, ecc.)
Una sorgente di radiazioni β (emesse da
tritio o 63Ni) provoca la ionizzazione del
gas di trasporto:
Analiti(X) con elevata affinità elettronica
possono catturare gli elettroni:
La ricombinazione fra ioni N2+e X- è 105-108volte più probabile di quella fra N2+
ed elettroni.
Si osserva una diminuzione di corrente al passaggio di analitielettron-affini


la sensibilità è ottima per gli idrocarburi clorurati
è un sistema non distruttivo
Rivelatore termoionico
Rispetto al FID è provvisto di una
perlina costituita da un sale di Rb o Cs,
riscaldata a 600-800 °C, dove avviene
la liberazione di ioni Rb+/Cs+:
Rb
Rb+ + e-
Gli atomi di rubidio interagiscono
selettivamente con i radicali generati
in fiamma da composti contenenti N
e P (CN. e PO2.), la cui affinità
elettronica è superiore al potenziale
di ionizzazione del Rb.
L’interazione fa aumentare il numero
di ioni Rb+ rilasciati dalla perlina e
quindi anche quello degli elettroni
che possono raggiungere l’anodo,
portando così ad un incremento
dell’intensità di corrente.



è specifico per composti
contenenti azoto e fosforo (per
questo è chiamato anche NPD)
basato sulla formazione di
radicali a partire da composti di
NeP
è un sistema distruttivo
La determinazione dei composti volatili è generalmente effettuata con la
gascromatografia (GC).
La GC è utilizzata per la separazione di sostanze volatili o volatilizzabili come
idrocarburi a basso peso molecolare, aromi, acidi organici.
Tra le varie versioni, particolarmente utilizzata in campo agroalimentare è quella
accoppiata alla spettrometria di massa (GC-MS) nella quale, è possibile avere
informazioni strutturali sulle sostanze separate
Interfaccia
cromatografo –
spettrometro di
massa
Spettrometro
di massa
al PC
Iniettore
Forno per
la colonna
15.0e6
12.5e6
10.0e6
7500e3
5000e3
2500e3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Impostazione
dei parametri
strumentali
Esempio di cromatogramma GC-MS
I database di cui
dispongono i moderni
strumenti
GC-MS
contengono gli spettri di
massa di circa 400.000
composti, tra cui quasi
tutti quelli di interesse
in chimica degli alimenti.
Per confronto, è sempre
possibile riconoscere i
composti separati
15.0e6
cromatogramma
12.5e6
10.0e6
7500e3
5000e3
2500e3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
tempo di ritenzione
4000e3
2500e3
120
3500e3
150
2250e3
2000e3
3000e3
1750e3
spettri
di massa
2500e3
91
2000e3
1500e3
135
1500e3
1250e3
1000e3
77
750e3
107
1000e3
65
500e3
51
500e3
51
250e3
77
105
136
0e3
0
25
50
75
m/z
100
125
144
63
89
117
0e3
150
0
25
50
75
100
m/z
166
125
150
175
175
Esempio di analisi GC-MS
Quale che sia il tipo di pretrattamento, l’analisi GC-MS dei composti
volatili permette di determinare un numero elevato di sostanze, quindi di
avere un set di dati molto ampio. In un vino sono determinabili 50-100
sostanze aventi caratteristiche di volatilità, in prevalenza alcoli, terpeni
ed esteri. Con opportuni trattamenti, è possibile ampliare ulteriormente il
gruppo di composti, a
vantaggio della possibilità
di caratterizzare le varietà
Nella figura è riportato un
esempio di analisi GC-MS di
un
estratto
da
vino
Nebbiolo