Panorama sulle principali
tecniche analitiche
STRUMENTALI
•Estratto da un lavoro fatto dall’università del Piemonte
nell’ambito del progetto «Ambiente» del 2005
•L’utilizzo è al solo scopo didattico»
Valutazione di una tecnica analitica
• Accuratezza  capacità di determinare il valore vero
• Precisione  capacità di replicare le misure
• Limite
di
rivelabilità

concentrazione
minima
di
analita che può essere rivelata
• Range dinamico lineare  range
di concentrazioni in cui la
risposta analitica è lineare
Segnale
• Sensibilità  capacità di
distinguere due concentrazioni
differenti ma molto vicine
Concentrazione
• Selettività  capacità di distinguere tra due analiti
• Effetti matrice  effetti di altre componenti del campione
sulla risposta analitica
Tecniche analitiche
• Tecniche
cromatografiche
• Tecniche spettroscopiche
Tecniche cromatografiche
• In base alla forma del letto cromatografico
• Cromatografia su colonna (impaccata, open-tubular)
• Cromatografia planare (su carta, su strato sottile)
• In base allo stato fisico della fase mobile
• Cromatografia Liquida (LC)
• Gascromatografia (GC)
• Cromatografia fluida supercritica (SFC)
• In base al meccanismo di separazione
• Adsorbimento
• Ripartizione
• Scambio ionico
• Esclusione
• Affinità
Schema delle tecniche
Dalla combinazione dei meccanismi e dei supporti citati, si possono avere
numerose varianti di tecniche cromatografiche
CROMATOGRAFIA
GAS
GSC
SFC
GLC
NP
LIQUIDA
Colonna
RP
IEC
Planare
SEC
GPC
GFC
TLC
Carta
Tecniche cromatografiche
• analiti volatili o volatilizzabili, termicamente stabili, non ionici

Gascromatografia
• analiti non volatili o poco volatili, ionici, ionizzabili o non ionici,
termicamente instabili

Cromatografia liquida
• analiti non volatili o termicamente instabili ma non rivelabili dai comuni
detector per LC

Cromatografia fluida supercritica
Gascromatografia
• Gas-liquido
• supporto inerte solido
• liquido non volatile, legato covalentemente
• meccanismo di ripartizione
• moltissime applicazioni
• Gas-solido
• fasi stazionarie di silice, allumina o carbone
• meccanismo di adsorbimento
• adatta per la separazione di gas permanenti (H2, He, Ar, O2,
N2, CO) o idrocarburi a basso punto di ebollizione
Schema di un GC
Colonne per gascromatografia
• Colonne impaccate
• contengono un supporto solido inerte, finemente suddiviso
(comumente basato su terra di diatomee), ricoperto di fase
stazionaria liquida
• Colonne capillari
• WCOT (Wall Coated Open Tubular), strato sottile di fase liquida (1
µm) depositato sulla superficie
• SCOT (Support Coated Open Tubular), strato poroso creato sulle
pareti della colonna per trattamento o deposizione chimica
• PLOT (Porous Layer Open Tubular), strato poroso polimerico o
inorganico che funge da fase stazionaria per una cromatografia di
adsorbimento
Confronto tra colonne impaccate e capillari
Le colonne capillari possono
essere lunghe fino a 100 m
e hanno quindi un numero di
piatti teorici enormemente
più elevato rispetto alle
colonne impaccate. Questa
differenza è esemplificata
nella figura a lato (in alto
separazione con colonna
capillare, in basso la stessa
separazione con colonna
impaccata)
Rivelatori per GC
• a conducibilità termica (TCD)
• a ionizzazione di fiamma (FID)
• a cattura di elettroni (ECD)
• a conducibilità elettrolitica (ELCD)
• amperometrico per lo zolfo (ASD)
• termoionico (TID o NPD)
• fotometrico a fiamma (FPD)
• a fotoionizzazione (PID)
• ad emissione atomica (AED)
• a chemiluminescenza
• spettrometria di massa (MS)
Uno dei punti di forza della tecnica
GC è la grande varietà dei rivelatori
disponibili. Alcuni sono aspecifici e
quindi di uso generale (TCD, FID),
altri sono invece molto specifici
(AED, ASD). Quelli universalmente
accettati sono TCD ed FID, ma è
sempre più diffuso l’impiego del
rivelatore a spettrometria di massa
Un aspetto da considerare nella
scelta del rivelatore è verificare se è
distruttivo o no: nel secondo caso può
essere interessante mettere in serie
più rivelatori (es. TCD e MS)
Rivelatore a conducibilità termica
• si misura la variazione di
conducibilità termica in
un flusso di H2 ed He
• si tratta di un rivelatore
non
specifico,
quindi
risponde ad ogni tipo di
composto
• la sensibilità è una delle
peggiori
•è
un
sistema
distruttivo
non
Campione
Riferimento
Rivelatore a ionizzazione di fiamma
• si misura la conducibilità elettrica
di una fiamma in un campo elettrico
• è sensibile a tutti i composti
contenenti legami C-C e C-H (per
questo si tratta del rivelatore più
utilizzato)
• non risponde a molecole volatili non
infiammabili
• la sensibilità è buona
• è un sistema distruttivo
Rivelatore a cattura di elettroni
• si misura la diminuzione di
corrente dovuta alla cattura
di elettroni da parte di analiti
all’uscita della colonna
• è sensibile soprattutto a
composti
con
gruppi
funzionali elettrofili (alogeni,
perossidi, nitrogruppi, ecc.)
• la sorgente di elettroni è un
beta-emettitore come 3H o
63Ni
• la sensibilità è ottima per gli idrocarburi clorurati
• è un sistema non distruttivo
Rivelatore a conducibilità elettrolitica
• si misura la conducibilità
elettrolitica modificata
da composti derivati
dagli
analiti
per
combustione
• è un rivelatore alogenospecifico
(pesticidi
clorurati,
solventi
alogenati, PCB, diossine)
ma può rivelare anche
composti di N ed S
• la sensibilità è eccellente per i composti clorurati, ottima per i
composti di N ed S
• è un sistema distruttivo
Rivelatore amperometrico per S
• le sostanze separate sono combuste in atmosfera riducente
formando H2S che viene rivelato in una cella elettrochimica per
ossidazione in-situ
• specifico per composti di S
• è un sistema distruttivo
Rivelatore termoionico
• è specifico per composti
contenenti azoto e fosforo
(per questo è chiamato anche
NPD)
• basato sulla formazione di
radicali a partire da composti
di N e P
• è un sistema distruttivo
Rivelatore fotometrico a fiamma
• è specifico per composti contenenti zolfo e fosforo
• si misura l’emissione ottica a 394 nm per S e 526 nm per P
• è un sistema distruttivo
Rivelatore a fotoionizzazione di fiamma
• si impiega luce UV per ionizzare gli analiti che escono dalla
colonna; gli ioni così prodotti generano una corrente misurata
• selettivo per idrocarburi aromatici e composti contenenti
eteroatomi (come organozolfo od organofosforo)
•è
un
sistema
praticamente non
distruttivo,
in
quanto la frazione
di analita ionizzato
è bassa
Rivelatore a emissione atomica
• rivelatore specifico per elementi, vantaggioso per l’analisi di
miscele complesse
• basato sull’emissione ottica di atomi formatisi in un plasma di
elio a microonde
• è un sistema distruttivo
Rivelatore a chemiluminescenza
• analogo come principio all’AED, ma la chemiluminescenza è
emessa da molecole eccitate piuttosto che da atomi
• le bande di luce emessa sono più ampie e più difficili da
interpretare
• la radiazione di fondo è bassissima, analogamente alla
fluorescenza (l’eccitazione è prodotta per via chimica, non
spettroscopica)
• limitato a composti che
possono
dare
reazioni
chemiluminescenti (composti
di N ed S soprattutto)
• è un sistema distruttivo
(l’analita reagisce con un
composto)
Rivelatore a spettrometria di massa
• accoppiamento ormai più che consolidato e di straordinaria
potenza
• è l’unico rivelatore che fornisce informazioni strutturali
• è un sistema distruttivo
Scelta del rivelatore
La selezione è basata su:
• natura chimica degli analiti
• potenziali interferenze
• limite di rivelabilità richiesto
• disponibilità e/o costo
Confronto tra rivelatori
Rivelatore
Target
LOD
Range lineare
TCD
non selettivo
1 ng
106
FID
idrocarburi
100 pg
107
ECD
alogeni
50 fg Cl
104
ELCD
composti di N, S, Cl
1 pg
104 - 106
ASD
composti di S
10 ppb S
104
NPD
composti di N, P
10 pg
104
FPD
composti di S, P
100 pg
103
PID
idrocarburi aromatici,
eterocomposti
2 pg benzene
107
AED
elementi
0.1 – 20 pg/s
104
Chem
composti di N, S
10 pg
104
MS
specie
10 ng (SCAN),
10 pg (SIM)
105
Cromatografia liquida
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
Colonna
NP
RP
IEC
Planare
SEC
GPC
GFC
TLC
Carta
Schema di un HPLC
Selezione della tecnica HPLC
Selezione della tecnica IC
Eluizione isocratica o in gradiente
isocratica
(più forte)
isocratica
(meno forte)
gradiente
Rivelatori per HPLC
• Bulk properties: si misura una caratteristica della fase
mobile che indirettamente rivela gli analiti
• Solute properties: si misura una caratteristica del soluto
• Spettrofotometrico UV-visibile (UV-Vis)
• UV-visibile con Diode-array (UV-DAD)
• Spettrofotometrico IR
• Fluorimetrico
• Indice di rifrazione (RID)
• Elettrochimico (ED)
• Spettrometria di massa (MS)
Rivelatore spettrofotometrico UV-visibile
• il rivelatore più diffuso
(copre più del 70% dei
metodi di rivelazione)
• basato sull’assorbimento
di luce nel range UVvisibile
• sensibile a moltissime
sostanze organiche ed
inorganiche (es. 254 nm)
• sensibilità tipica: 0.1 ppb
•è
un
sistema
distruttivo
non
Gruppi cromofori
Cromoforo
Formula
lmax (nm)
e
aldeide
-CHO
210
1.500
amino
-NH2
195
2.800
azo
-N=N-
285-400
3-25
bromuro
-Br
208
300
carbossile
-COOH
200-210
50-70
chetone
-C=O
195
1.000
disolfuro
-S-S-
194
5.500
estere
-COOR
205
50
etere
-O-
185
1.000
etilene
-C=C-
190
6.000
fenile
-C6H5
202, 255
naftile
220, 275
nitrato
-ONO2
270
12
nitrito
-ONO
220-230
1.000-2.000
nitrile
-C=N
160
-
nitro
-NO2
210
forte
Scelta della lunghezza d’onda
La l del rivelatore va scelta in base ad alcune considerazioni:
• massimizzare sensibilità e specificità
• il solvente della fase mobile può causare shifts in lmax (2-5 nm)
• controllare l’assorbanza degli analiti nella fase mobile
• i solventi per fase mobile hanno cutoff nell’UV
• operando sotto la lcutoff può:
• ridurre la sensibilità
• introdurre rumore sulla linea di base
Rivelatore Diode-array
• misura in ogni istante lo spettro
dell’eluato nell’intervallo desiderato
UV-visibile
• può fornire informazioni
strutturali sugli analiti
(database di spettri)
Rivelatore spettrofotometrico IR
• sensibilità tipica: 1 ppm
• applicabilità limitata dall’assorbanza
mobile nel range spettrale infrarosso
della
fase
Rivelatore a fluorescenza
• sensibilità 1000 volte
superiore
rispetto
all’assorbimento
UVvisibile
• sensibilità
ppb
tipica:
0.01
• limitato alla rivelazione
di composti fluorescenti,
ma
è
possibile
la
derivatizzazione
•è
un
sistema
non
distruttivo (tranne che
con derivatizzazione)
Rivelatore a indice di rifrazione
• basato
sulla
misura
del’indice di rifrazione
dell’eluato
(tipico
rivelatore bulk)
• sensibilità tipica: 0. 1 ppm
• non adatto con eluizione in
gradiente
• completamente aspecifico
• necessita di termostatazione accuratissima
• si usa per composti non attivi nel range UV-visibile (zuccheri)
• è un sistema non distruttivo
Rivelatore evaporative light scattering
• l’eluato è trasformato in
aerosol, desolvatato e mandato
in una cella nella quale si misura
lo scattering della luce
• necessita di fasi mobili volatili
• ideale per composti ad alto PM,
zuccheri e acidi non volatili
• è un sistema distruttivo
Rivelatore elettrochimico
• tra i più sensibili (sensibilità tipica: 1 ppt, femtomoli in modalità
amperometrica)
• possibilità di misura in
• voltammetria (per applicazioni particolari)
• amperometria
• coulometria (raro)
• conducimetria (utilizzato in cromatografia ionica)
• generalmente poco adatto all’eluizione in gradiente
Rivelatore elettrochimico: amperometria
• basata sulla misura della corrente risultante da un’elettrolisi
(ossidazione o riduzione) di molecole di analita alla superficie di
un elettrodo
• il più sensibile tra i rivelatori per LC (fino a femtomoli per
alcune applicazioni  dopamina)
• utilizzabile per tutte le sostanze elettroattive nel range di
potenziale dell’elettrodo
di lavoro impiegato
• possibile avvelenamento
degli elettrodi
• utilizzo non semplice
• è un sistema parzialmente
distruttivo
Rivelatore elettrochimico: conducimetria
• basato sulla misura della corrente elettrica trasportata da ioni
disciolti in un campo elettrico
• utile per sostanze ioniche o ionizzabili
• rivelatore più comune in cromatografia ionica
• sensibilità
inferiore
rispetto al rivelatore
amperometrico
• utilizzo molto semplice
•è
un
sistema
distruttivo
non
Rivelatore a spettrometria di massa
• il detector finale:
sensibile, selettivo e
universale,
può
permettere
la
caratterizzazione
chimica del campione
• possibilità
di
discriminare analiti
coeluiti in modalità
SIM
• sensibilità tipica: 0.1 ppb
• limitato dall’interfaccia e dalla necessità di rimuovere il solvente dal
campione
• gli analiti devono essere ionizzabili
Confronto tra rivelatori
Rivelatore
Target
LOD
Range lineare
UV-visibile/
UV-DAD
composti che assorbono
luce UV-VIS
1 µg/l
104
Fluorimetrico
composti policondensati
(PAH)
10 ng/l
103
RID
non selettivo
1 mg/l
104
IR
1 mg/l
ELSD
ED
amperometrico
composti elettroattivi
100 pg/l
ED
conducimetrico
composti ionici
1 µg/l
103
MS
specie
0.1 µg/l
105
Cromatografia Fluida Supercritica
• si utilizza come fase mobile un fluido supercritico (cioè portato al di
sopra della temperatura critica, Tc, sopra la quale una sostanza non
può più essere trasformata in un liquido), avente caratteristiche
fisiche intermedie tra i liquidi e i gas:
• maggiore densità rispetto ai gas
• minore viscosità rispetto ai liquidi
• alto potere solubilizzante
• Fluidi supercritici impiegati in
cromatografia:
• CO2, Tc = 31°C
• C2H6, Tc = 32°C
• N2O, Tc = 37°C
Caratteristiche della SFC
• è utile in particolare per analizzare composti che non possono
essere determinati con GC o LC (25% dei problemi analitici):
• composti non volatili
• composti termicamente instabili
• composti non rivelabili con i normali rivelatori per LC
• la strumentazione è simile a quelle per GC o LC; necessita
controllo accurato della temperatura
• fasi mobili analoghe a quelle per HPLC in ripartizione
• l’eluato si rivela come gas 
(interfacciamento semplice), TCD, ECD
rivelatori
FID,
MS
Applicazioni della SFC
• separazione di molecole ad alto PM (fino a 105), prodotti
naturali, alimenti, additivi, pesticidi, polimeri, esplosivi
• CO2 supercritico può solubilizzare alcani C5-C40 e PAH
separazione di polietileni
oligomerici con gradiente
di pressione
Confronto tra HPLC ed SFC
Separazione di bi- e
trifenile con HPLC (sx)
ed SFC (dx): la velocità
di flusso è maggiore in
SFC
per
cui
la
separazione è più veloce
GC, LC o SFC?
• Caratteristiche comuni
• Efficienti e altamente selettive; non distruttive (in senso analitico); possono
essere quantitative
• Vantaggi della GC
• Rapida; risoluzione eccezionale; facilmente interfacciabile con MS
• Vantaggi della LC
• Determinazione di specie non volatili o termicamente instabili, specie
ioniche inorganiche
• La diffusione longitudinale è trascurabile
• Vantaggi della SFC
• caratteristiche intermedie tra GC ed LC
Tecniche elettroforetiche
Le tecniche elettroforetiche sono spesso associate alle tecniche
cromatografiche, in quanto permettono la separazione di miscele di ioni
che migrano sotto l’effetto di un campo elettrico con diverse velocità di
migrazione. In realtà non si tratta di metodi cromatografici veri e
propri, in quanto non avviene la ripartizione degli analiti tra fase mobile e
fase stazionaria. Per questo sono chiamate anche tecniche ancillari
rispetto alle cromatografiche. La strumentazione richiesta è comunque
affine e quindi sono valide molte delle nozioni acquisite in campo
cromatografico. La rivelazione delle sostanze avviene mediante
colorazione, per via fotometrica o, nell’elettroforesi capillare, con
rivelatori più sofisticati come il fotometrico, l’elettrochimico e lo
spettrometro di massa
Si tratta di un gruppo di tecniche molto utilizzate in campo biologico,
biochimico e molecolare per la separazione di proteine, polinucleotidi e
altri biopolimeri, e in generale di ioni e anfoliti (sostanze che si
comportano come acidi o basi a seconda del pH, es. aminoacidi e peptidi)
Classificazione delle tecniche
Le tecniche elettroforetiche si classificano in:
• elettroforesi priva di carrier, in
cui gli ioni migrano in una soluzione
tampone
• elettroforesi mediante carrier,
più comunemente utilizzata, in cui
gli ioni migrano su un supporto di
carta, un gel o un polimero
• elettroforesi
classica
(es.
separazione delle proteine del
siero)
• elettroforesi capillare
Elettroforesi capillare
Due grossi svantaggi dell’elettroforesi classica sono:
• convezione di calore dovuta alla resistenza del tampone al
flusso di corrente elettrica, che porta all’allargamento dei
picchi
• difficoltà nella valutazione degli elettroferogrammi
Questi svantaggi sono superati grazie all’avvento della tecnica
capillare, derivata da elementi della GC capillare. In questa
tecnica, la migrazione degli ioni avviene in un sistema
miniaturizzato, un capillare appunto, nel quale le correnti sono
inferiori e conseguentemente il calore di Joule è notevolmente
più basso con vantaggi analitici evidenti
Prestazioni dell’elettroforesi capillare
La strumentazione necessaria per l’elettroforesi capillare è costituita da due
soluzioni tampone, il capillare con dispositivo di raffreddamento, un generatore di
energia ad alta tensione, un sistema per l’applicazione del campione e un rivelatore
Si utilizzano rivelatori
spettrometria di massa
UV,
UV-DAD,
fluorimetrici,
elettrochimici
e
a
Versioni della CE
L’elettroforesi capillare comprende una famiglia di tecniche che hanno
caratteristiche operative e di separazione alquanto diverse. Le tecniche sono:
• elettroforesi capillare di zona (CZE): è la forma più semplice di CE, in cui le
molecole sono separate in base alle differenze nel rapporto massa/carica
• elettroforesi capillare ad alta prestazione (HPCE): evoluzione della CE
tradizionale
• elettroforesi capillare a gel: è l’adattamento della tecnica tradizionale di
elettroforesi su gel operata su un capillare contenente un mezzo anticonvettivo
come la poliacrilamide
• focusing isoelettrico (IEF): molecole cariche migrano in un campo elettrico nel
quale un gradiente di pH le porta al loro punto isoelettrico
• isotacoforesi (ITP): le particelle migrano nel campo elettrico alla stessa
velocità
• cromatografia capillare elettrocinetica micellare (MECC): l’addizione di
sostanze in grado di formare micelle permette la separazione di molecole
neutre (es. fenoli)
Vantaggi della CE
• utilizza la moderna tecnologia dei rivelatori in modo che gli
elettroferogrammi assomigliano molto ai cromatogrammi
• l’efficienza è analoga a quella della GC capillare o migliore (N
piatti teorici elevatissimo)
• richiede una quantità minima di campione e di reagenti
• può essere facilmente automatizzata
• è applicabile ad un range di analiti più ampio rispetto alle altre
tecniche separazione
Selezione della tecnica più adatta
Le varie versioni della CE hanno caratteristiche che le rendono più
adatte in certe situazioni. Nella tabella sono elencate in ordine di
efficienza decrescente per la separazione delle diverse classi di analiti
Ioni a
basso PM
Molecole a
basso PM
Peptidi
Proteine
Oligo
nucleotidi
DNA
CZE
MECC
CZE
CZE
CGE
CGE
ITP
CZE
MECC
CGE
MECC
ITP
IEF
IEF
CGE
ITP
Applicazioni della CE
Dal momento che la stragrande maggioranza delle molecole di interesse
biologico è carica, la CE ha applicazioni importanti nell’analisi di
aminoacidi, peptidi, proteine, acidi nucleici a altri biopolimeri, con tempi
di analisi minori rispetto a tecniche cromatografiche equivalenti (SEC).
In particolare, per l’analisi di proteine e peptidi è possibile separare
analiti che differiscono per un solo aminoacido. Nella figura è mostrata
l’analisi di una soluzione di albumina di siero bovino digerita con tripsina
Applicazioni della CE
Altre applicazioni comprendono la separazione di anioni e cationi
inorganici e di composti farmaceutici purchè carichi
Separazione con MECC di aminoacidi (sx) e di corticosteroidi (dx)
Tecniche spettroscopiche
Interazione tra luce e materia

Tecniche spettroscopiche
• Informazione qualitativa (elementi, composti)
• Informazione quantitativa (concentrazione)
Lo spettro elettromagnetico
I vari intervalli dello spettro elettromagnetico sono sfruttati a scopo
analitico per ottenere informazioni strutturali quali-quantitative sulla
materia analizzata
Energia
l
Classificazione delle tecniche spettroscopiche
• In base al meccanismo
• In base alla specie interessata
• assorbimento
• atomica
• emissione
• molecolare
• fluorescenza
• In base alla regione spettrale impiegata
• raggi g (0.01 Å)
 PIGE
• raggi X (0.01 Å – 100 Å)
 XRF, PIXE
• UV-Visibile (10 nm – 800 nm)
 AAS, ICP-AES
• IR (800 nm – 0.4 mm)
 FT-IR
• microonde (0.4 mm – 0.25 m)
 EPR
• radiofrequenze (> 0.25 m)
 NMR
Assorbimento ed emissione di luce
S1
A livello microscopico la luce
interagisce con la materia in
modalità
differenti
ma
sempre legate a salti tra stati
energetici
~~~ E = h
S0
L’assorbimento e l’emissione
di luce da parte della materia
sono
interpretabili
come
passaggio tra due stati di
energia di un atomo o una
molecola
Spettroscopia atomica e molecolare
• Spettroscopia atomica: il campione è trasformato in
atomi somministrandogli energia  si determinano
elementi
• Spettroscopia molecolare: il campione è analizzato
tal quale  si determinano composti
Regioni spettrali utilizzate
Irraggiando la materia con la radiazione luminosa si creano
effetti diversi a seconda dell’energia della radiazione utilizzata:
• raggi g e raggi X provocano transizioni elettroniche nei gusci
interni e reazioni nel nucleo
• raggi UV e visibile causano transizioni elettroniche nei gusci
esterni
• raggi infrarossi causano transizioni vibrazionali e rotazionali
• microonde e onde radio interessano l’orientazione degli spin
elettronici e nucleari
Spettroscopia atomica
• Il campione è trasformato in atomi con metodi vari di
riscaldamento
• Il vapore atomico subisce un interazione con la luce
oppure con un campo magnetico; l’entità di questa
interazione fornisce la risposta analitica, qualitativa
e quantitativa
Tecniche atomiche
A seconda del tipo di interazione che subisce il vapore atomico, si
possono avere le seguenti tecniche di spettroscopia atomica:
• il vapore è irraggiato con una
radiazione
monocromatica
assorbibile solo dagli atomi di un
determinato elemento
Assorbimento atomico
• il vapore subisce un riscaldamento
ulteriore e gli atomi emettono il
surplus di energia sotto forma di
radiazione luminosa
Emissione atomica
• il vapore subisce un riscaldamento
ulteriore e gli atomi si trasformano
in ioni i quali sono separati e rivelati
con uno spettrometro di massa
Spettrometria di massa
Spettroscopia atomica: assorbimento
• il campione è trasformato in atomi con metodi vari di
riscaldamento
• il vapore atomico subisce un’interazione con la luce emessa da
una sorgente luminosa (righe)
• la riga viene assorbita solo dagli atomi corrispondenti mediante
l’assorbimento di risonanza
• l’entità di questa interazione fornisce la risposta analitica
• qualitativa (quali elementi)
• identificazione attraverso le l assorbite
• quantitativa (qual è la concentrazione)
• calibrazione con soluzioni a concentrazione nota
• legge di Lambert-Beer (A = ebC)
Spettrofotometria AAS
Metodo di
atomizzazione
Fiamma
Elettrotermico
Temperatura di
atomizzazione (°C)
1700-3150
1200-3000
Tecnica
FAAS
ET-AAS (GF-AAS)
Assorbimento atomico a fiamma (FAAS)
comparto della
fiamma
regolazione
dei gas
introduzione del
campione
combustibile (acetilene) + comburente (aria)  fiamma
Assorbimento atomico a fiamma (FAAS)
cammino ottico
• aspirazione in continuo
• segnale dipendente dalla
concentrazione e non dalla
massa
Atomizzazione elettrotermica (ETAAS)
Elettrotermica (ET): atomizzazione mediante una corrente
elettrica ad alta potenza che crea un riscaldamento per effetto
Joule
Atomizzazione elettrotermica (ETAAS)
il campione (poche decine di µl) viene depositato all’interno di un
cilindro di grafite detto fornetto, sottoposto poi a cicli di
riscaldamento
Fornetti di grafite
• Il fornetto di grafite ha
dimensioni di pochi cm
• La tecnica è nota anche come
GF-AAS
Spettroscopia atomica: emissione
• il campione è trasformato in atomi con metodi vari di
riscaldamento
• il vapore atomico emette luce emessa a righe in conseguenza
dell’energia somministratta sotto forma di calore
• le righe emesse vengono separate e misurate
• l’entità dell’emissione fornisce la risposta analitica
• qualitativa (quali elementi)
• identificazione attraverso le l emesse
• quantitativa (qual è la concentrazione)
• calibrazione con soluzioni a concentrazione nota
• intensità propozionale alla concentrazione (I = C)
Spettrofotometria AES
Metodo di
atomizzazione
Fiamma
Plasma IC
Temperatura di
atomizzazione (°C)
1700-3150
6000-8000
Tecnica
FAES (FF)
ICP-AES
Emissione atomica a fiamma (FF)
comparto della
fiamma
regolazione
dei gas
introduzione del
campione
utilizzo lo stesso strumento senza sorgente ottica
Emissione atomica con plasma (ICP-AES)
Spettrofotometria ICP-AES
Sistema ottico
Smaltimento fumi
Torcia di quarzo
al PC
Nebulizzatore
Camera di nebulizzazione
2 canali:
1 per il campione
1 per lo scarico
Pompa peristaltica
Spettrometria di massa con plasma (ICP-MS)
Metodo di
atomizzazione
Plasma IC
Temperatura di
atomizzazione (°C)
6000-8000
Tecnica
ICP-MS
Spettrometria ICP-MS
Spettrometria ICP-MS
Spettrometro di
massa e rivelatore
Interfaccia
Torcia ICP
Introduzione del campione
Caratteristiche tecniche
• tecniche distruttive (1500-8000 °C)
• si determinano elementi
• si analizzano liquidi, solidi se disciolti
• analisi totale del campione
• risultati espressi in concentrazione
• ottima sensibilità
• mg/l per FAAS e FF
• µg/l per GFAAS e ICP-AES
• ng/l per ICP-MS
Confronto tra tecniche
Limiti di rivelabilità
Spettroscopia molecolare
• Il campione è irraggiato con luce avente l nell’UV, nel visibile o
nell’infrarosso
• Le molecole che compongono il campione assorbono l’energia
irradiata se essa è in quantità sufficiente per far vibrare i loro
gruppi funzionali (visibile, IR) oppure per promuovere
transizioni elettroniche (UV, visibile)
• La risposta del campione viene registrata e, in base ai segnali
raccolti, è possibile risalire alla composizione del campione in
termini di molecole
• Le tecniche più
assorbimento
comunemente
utilizzate
sono
quelle
in
Spettroscopia molecolare: assorbimento
• il campione è irraggiato con luce avente l nell’UV, nel visibile o
nell’infrarosso (bande o righe)
• le molecole che compongono il campione assorbono l’energia irradiata se
essa è in quantità sufficiente per far vibrare i loro gruppi funzionali
(visibile, IR) oppure per promuovere transizioni elettroniche (UV,
visibile)
• la risposta del campione viene registrata e, in base ai segnali raccolti, è
possibile risalire alla composizione del campione in termini di molecole
• l’entità di questa interazione fornisce la risposta analitica
• qualitativa (quali composti)
• identificazione attraverso le l assorbite
• quantitativa (qual è la concentrazione)
• calibrazione con soluzioni a concentrazione nota
• legge di Lambert-Beer (A = ebC)
Spettrofotometria IR
Il campione è irraggiato con un intervallo più o meno ampio di l; le
l assorbite corrispondono ai gruppi funzionali delle molecole, i
quali assorbono l’energia equivalente per vibrare. La risposta è
visibile sotto forma di spettro di assorbimento
Esempio di spettrofotometro IR.
Si tratta in genere di strumento
molto compatti
I campioni liquidi sono analizzati
tal quali, mentre per i campioni
solidi si prepara una pastiglia di
KBr nel quale si disperde il
campione polverizzato; è possibile
analizzare anche i campioni
gassosi
IR: modi di vibrazione
Alcuni modi di vibrazione sono gli
stretching
(allungamenti)
e
i
bending
(piegamenti)
che
corrispondono a livelli energetici
ben definiti
Esempio di spettro IR
Il campione è irraggiato con un intervallo di l compreso tra 2.5 e
20 µm (o  compreso tra 4000 e 500 cm-1). Il 100% della scala di
trasmittanza corrisponde ad assorbimento nullo
Spettrofotometria IR
Ogni gruppo funzionale ha modi di vibrazione corrispondenti a l o
 ben definite, che ne permettono l’identificazione
Impronta digitale
L’insieme dei gruppi
funzionali identificati
permette di risalire
globalmente
alla
molecola, lo spettro
IR
della
quale
corrisponde
ad
un’impronta digitale
Spettro IR della formaldeide
H
C
H
O
L’assegnazione delle bande di assorbimento ai vari modi di
vibrazione permette di risalire in modo ancora più accurato alla
struttura della molecola
Applicazioni IR
Esempi di applicazioni della tecnica IR:
• caratterizzazione strutturale di prodotti di sintesi
• caratterizzazione strutturale di intermedi di sintesi
• monitoraggio di cinetiche di reazione
• caratterizzazione della purezza di un composto
• raramente utilizzata per determinazioni quantitative
Spettrofotometria UV-visibile
Il campione è irraggiato con un intervallo più o meno ampio di l; le l
assorbite, aventi energia sufficiente a promuovere transizioni
elettroniche, corrispondono ai gruppi funzionali delle molecole. La
risposta è visibile sotto forma di spettro di assorbimento
Gli
spettrofotometri
UV-visibile sono molto
diffusi per la loro
semplicità di utilizzo e
versatilità e per il basso
costo; quasi tutte le
sostanze
organiche
presentano assorbimenti
nel range strumentale
(180-800 nm)
Un
utilizzo
molto
comune si ha come
rivelatore per HPLC
Transizioni elettroniche
La spettroscopia UV-visibile è detta anche spettroscopia elettronica
perchè è basata su transizioni di elettroni tra livelli energetici diversi
Le transizioni elettroniche più comuni sono illustrare nella figura
sottostante. Esse si verificano se nel campione sono presenti molecole
aventi cromofori, cioè gruppi funzionali in grado di assorbire la luce,
come il gruppo –NO2 (nitro), -N2- (azo), ecc.
Solo le transizioni di elettroni n e  hanno energie nel range 200-800 nm
Esempio di spettro UV-visibile
Esempio di spettro UV-visibile
di un’aldeide insatura. La
banda a 395 nm rende conto
del fatto che il composto è
colorato in arancio, colore
complementare rispetto al
violetto che corrisponde alla
regione spettrale interessata
(~ 400 nm).
Le bande di assorbimento
registrate sono in numero
minore rispetto all’IR, tuttavia
è possibile utilizzarle per
effettuare
determinazioni
quantitative secondo la legge
di Lambert-Beer
Tabella dei gruppi cromofori
Alcuni esempi di gruppi cromofori con i relativi coefficienti di estinzione molare o
assorbività molare (e)
Cromoforo
Esempio
Transizione
lmax (nm)
e
Solvente
C=C
Etene
  *
171
15.000
Esano
C=C
1-Esino
  *
180
10.000
Esano
Etanale
n  *
  *
290
15
180
10.000
N=O
Nitrometano
n  *
  *
275
17
200
5.000
C-X
X = Br
X=I
Metil bromuro
Metil ioduro
n  *
n  *
205
200
255
360
C=O
Esano
Etanolo
esano
Applicazioni dell’UV-visibile
• caratterizzazione strutturale di prodotti di sintesi
• monitoraggio di cinetiche di reazione
• caratterizzazione della purezza di un composto o di un prodotto
naturale (es. olio, vino)
• determinazione quantitativa di specie di interesse chimicoclinico o ambientale (A = ebC)
• rivelazione in sistemi cromatografici
Caratteristiche tecniche
• tecniche distruttive o non distruttive
• si determinano composti
• si analizzano liquidi, solidi o gas
• analisi totale o parziale del campione
• risultati espressi in concentrazione
• buona sensibilità (mg/l)
Tecniche molecolari: Raman
Il campione è irraggiato con luce monocromatica; le l assorbite,
aventi energia minore rispetto alla l irraggiata, corrispondono ai
gruppi funzionali delle molecole, i quali assorbono la differenza di
energia per vibrare. A differenza dell’IR, non si misura la luce
assorbita ma quella che viene restituita o diffusa dai gruppi
funzionali dopo l’assorbimento. La risposta è visibile sotto forma
di spettro
Spettro Raman di
un pigmento
Caratteristiche tecniche
• tecniche distruttive o non distruttive
• si determinano composti
• si analizzano liquidi, solidi o gas
• possibili analisi in situ
• analisi totale o parziale del campione
• risultati espressi in concentrazione
• buona sensibilità
Fluorescenza a raggi X
Il campione è colpito con un fascio di raggi X dalla sorgente. Gli
elementi presenti localmente vengono eccitati, cioè passano ad
uno stato energetico superiore, dal quale decadono
istantaneamente emettendo radiazioni X monocromatiche
specifiche per ogni elemento
L’intensità delle radiazioni
emesse è correlabile alla
concentrazione
degli
elementi
presenti
nel
campione
nel
punto
irraggiato
La zona irraggiata
essere di 3-100 mm2
può
Caratteristiche tecniche
• tecnica non distruttiva o distruttiva
• si determinano elementi
• si analizzano liquidi, solidi
• possibilità di analisi in situ
• buona risoluzione spaziale
• risultati espressi in concentrazione
• sensibilità discreta
Altre tecniche spettroscopiche
Esistono altre tecniche di analisi nelle quali si sfrutta
l’interazione della materia con un campo magnetico e/o con una
radiazione luminosa
Le tecniche principali in questo settore sono due:
• la spettrometria di massa
• la risonanza magnetica nucleare o NMR
Queste tecniche vengono generalmente considerate tecniche
spettroscopiche al pari di quelle descritte in precedenza
Spettrometria di massa (MS)
Nella spettrometria di massa
le molecole sono trasformate
in ioni i quali, attraverso
l’interazione con un campo
elettromagnetico,
sono
separati e analizzati per
fornire informazioni sul peso
molecolare e la struttura
della molecola progenitrice
Esempio di spettri MS
in questo esempio il campione è costituito da H2O. Attraverso la
sorgente si possono formare lo ione molecolare (H2O + e-  H2O+
+ 2 e-) e i frammenti H+, O+ e OH+
specie
massa
H2O+
18
OH+
17
O+
16
H+
1
I segnali degli ioni sono
riportati assegnando allo
ione più abbondante il 100%
e mostrando gli altri ioni
come percentuale di esso
Applicazioni della tecnica MS
Le applicazioni della tecnica MS spaziano in tutti i campi della
scienza. In particolare:
• analisi ambientale (determinazione di composti tossici come
diossine, PCB, PAH, ecc.)
• caratterizzazione di composti di interesse biologico o
farmaceutico (macromolecole, prodotti di ingegneria genetica,
principi attivi, ecc.)
• analisi di materiale di interesse agroalimentare (prodotti
naturali e sintetici, ecc.)
• rivelatore per cromatografia, sia GC che LC
Risonanza Magnetica Nucleare (NMR)
Questa tecnica analitica è da ormai 50
anni la più utilizzata nel campo della
caratterizzazione della struttura di
sostanze
organiche;
ha
buone
potenzialità anche in campo inorganico
Le caratteristiche tecniche dell’NMR
ne fanno però uno strumento da
ricerca più che da laboratorio, per
quanto
alcune
applicazioni
siano
entrate nella routine, per esempio
nell’ambito del controllo in campo
alimentare
La tecnica si basa sull’interazione tra atomi aventi numero di spin
non nullo posti in un campo magnetico, e una radiazione
elettromagnetica nel campo delle radiofrequenze
Nuclei e numeri di spin
Alcuni esempi di specie con numero di spin nullo o non nullo sono
riportate nella tabella seguente
Numero
di protoni
Numero
di neutroni
Numero
di Spin
Esempi
NMR-attivo
pari
pari
0
12C, 16O, 32S
no
dispari
pari
1/2
1H, 19F, 31P
si
dispari
pari
3/2
11B,35Cl, 79Br
si
pari
dispari
1/2
13C
si
pari
dispari
3/2
127I
si
pari
dispari
5/2
17O
si
dispari
dispari
1
2H, 14N
no
Schema di uno spettrometro NMR
Chemical shift: esempi
Esempio di spettro 1H NMR
acido dimetilbenzoico
Esempio di spettro
13C
NMR
Tecniche accoppiate
Le tecniche accoppiate o ifenate (dall’inglese hyphen che indica il
trattino di sillabazione) sono costituite dall’interfacciamento di
un sistema separativo ad un sistema di rivelazione spettroscopica
Questa combinazione sfrutta i vantaggi di entrambi i sistemi:
• la parte cromatografica produce frazioni pure di analita
• la parte spettrale fornisce informazioni su un componente puro
Le tecniche ifenate più comuni sono GC-MS ed LC-MS, disponibili
in versioni commerciali largamente diffuse. Altre tecniche sono
meno diffuse, es. GC-AES, LC-ICPMS. A parte GC-MS, si tratta
normalmente di strumenti disponibili a grandi centri di ricerca
Informazioni fornite
Le grandi potenzialità delle tecniche ifenate sono legate alle
informazioni strutturali che forniscono sul campione
• spettri di massa
• determinazione di specie diverse di uno stesso elemento
Determinazione di metalli
Combinazioni possibili
• step di cleanup della matrice
• step di preconcentrazione
• possibilità di studi di speciazione
Criteri di scelta: separazione
Scelta della fase mobile o del carrier
rivelatore
gassoso
secco
acquoso
organico
salino
AFS
+++
+++
X
X
X
FAAS
++
+
+++
++
++
ICP-AES
++
++
+++
+
++
ICP-MS
++
++
+++
+
X
• carrier gassoso (solo per elementi che formano idruri)
• GC-AFS
• IEC-(postcolumn-HG)-AFS
• carrier organico (specie lipofiliche)
• RP-HPLC-FAAS
• RP-HPLC-ICP-AES (necessaria desolvatazione)
• RP-HPLC-ICP-MS (necessaria desolvatazione)
• tamponi (specie ioniche e non ioniche)
• IEC-ICP-MS (solo tamponi < 50 mM)
• Ion pair-RP-HPLC-ICP-AES
+++ necessario
++ possibile
+ in condizioni specifiche
X non utilizzabile
Criteri di scelta: rivelazione
• in base agli analiti da determinare
• As, Se, Hg, Sb  AFS
• Cu, Zn, Cr  FAAS
• in base alla concentrazione
• elementi maggiori  FAAS
• tracce  AFS, ICP-AES
• ultratracce  AFS, ICP-MS
• il rivelatore deve poter funzionare in modalità continua
• il sistema deve generare segnali transienti
Speciazione di elementi volatili
Se, As, Sb, Te, Hg, (Sn) formano idruri volatili  LC-HG-AFS
Separazione di composti organoarsenici
GC-ICP-MS
• solo per elementi che
formano
composti
volatili
• necessita
di
derivatizzazione (HG o
etilazione)
• 100 % di campione
introdotto nel detector
(sensibilità elevata)
• nessun
problema
di
interfaccia
(carrier
gassoso!)
Speciazione di organometalli
Speciazione di composti
organostannici (5 ppb)
GC-ICP-AES
• meno sensibile di GC-ICPMS
• interfacciamento semplice
• produce uno spettro di emissione per ogni analita
GC-FTIR
• può
distinguere
isomeri
strutturali che presentano
lo stesso spettro di massa
• fornisce informazioni sulla
struttura molecolare anche
in assenza di un esatto
riferimento
• limitazione: librerie povere
(poche migliaia di spettri
contro 250.000 spettri in
MS), in quanto la maggior
parte degli spettri è in fase
liquida o solida, ma in fase
gas sono diversi
CE-ICP-MS
• richiede un’interfaccia speciale
• effetti matrice elevati
• consumo di campione bassissimo (nL)
• risoluzione eccellente